Pri diferenciálnom určovaní enterobaktérií a niektorých vibrácií zaujíma Voges-Proskauerova reakcia osobitné miesto. Test je založený na schopnosti baktérií fermentovať glukózu za vzniku acetoínu.
Podstata výskumného procesu
V mikrobiológii sa Voges-Proskauerova reakcia často používa na rozlíšenie enterobaktérií z rodiny Yersinia (vrátane patogénov pseudotuberkulózy a enterokolitídy), Escherichia coli a aeróbov tvoriacich spóry. Výsledok sa zviditeľní zafarbením média po pridaní určitých činidiel.
Tento test patrí do série IMViC (skratka Indol, Methyl Red, Voges-Proskauer i Citrate) - skupina identifikačných testov vrátane diferenciálnych definícií:
- s indolom, na základe rozkladu tryptofánu na indol, použitého v prítomnosti Kovacsovho alebo Ehrlichovho činidla;
- pomocoumetylroth alebo metylová červeň, ktorá deteguje dané pH ako výsledok metabolizmu glukózy;
- Voges-Proskauerove reakcie na detekciu acetyl-metylkarbinolu;
- využitie citrátu so zmenou farby v dôsledku alkalizácie média.
Podstatou procesu je vizualizácia prítomnosti diagnostikovaných baktérií v dôsledku interakcie nimi vytvoreného acetoínu s hydroxidom draselným v prítomnosti kyslíka. Acetyl-metylkarbinol sa oxiduje na diacetyl, ktorý tvorí jasne červenú alebo ružovú zlúčeninu. Zvýšte citlivosť testu zavedením alfa-naftolu pred pridaním hydroxidu draselného.
Nastavenie testu
Formulácia Voges-Proskauerovej reakcie zahŕňa predbežnú kultiváciu mikroorganizmov. Čistá kultúra sa vysieva na Clarkovo diferenciálne diagnostické médium, ktorého obmenou je Clarkov bujón (bez pridania agaru-agaru). Používa sa buď hotové médium, alebo sa pripravuje nezávisle. Zloženie obsahuje:
- 5g peptónu;
- 5g glukózy;
- 5 g hydrogenfosforečnanu draselného;
- 1l destilát.
Počas štúdie sa kultúra naočkuje sterilnou bakteriologickou slučkou do tekutého média. Množstvo - 5 ml v skúmavke plus kontrola. Inkubácia sa uskutočňuje pri teplote 35-37 stupňov počas dvoch dní. Ďalej sa uskutočňuje štúdia Voges-Proskauerovej reakcie v etapách:
- 2, 5 ml bujónovej kultúry sa prenesie do sterilnej skúmavky.
- Pridajte šesť kvapiek alfa-naftolu (5% roztok alkoholu).
- Pridať 40 %roztok hydroxidu draselného v množstve 0,1 ml alebo dve kvapky.
- Miešanie sa vykonáva jemným potrasením skúmavky.
- Výsledok vyhodnoťte po 15 minútach od začiatku experimentu.
Alternatívnou testovacou metódou je inkubácia cez noc, ktorej čas je skrátený na 18 hodín alebo až na jeden deň. Okrem tejto metódy sa používa aj expresný test: kultúra sa vloží do slučky do 2 ml média, inkubuje sa asi štyri hodiny, potom sa pridajú činidlá v rovnakom množstve 2-3 kvapky, premiešajú sa a výsledok sa vyhodnotí po desiatich minútach.
Kontrola je jedným z pôvodcov pneumónie Klebsiella pneumoniae - kmeň atcc 13883.
Vyhodnotenie výsledku
Po požadovanom čase po pridaní činidiel (od 5 do 15 minút) by mala byť pozorovaná čerešňovo-červená farba s výraznou pozitívnou reakciou, červená a ružová - so slabou pozitívnou reakciou. Žiadna zmena sa nezaznamená ako negatívny výsledok.
Prebytok hydroxidu draselného v roztoku môže spôsobiť imitáciu pozitívnej reakcie, sfarbenie do medenej farby. V tomto prípade by sa mala zaznamenať negatívna odpoveď testovanej kolónie. Sfarbenie medi sa objavuje aj v prípadoch, keď sa hodnotenie vykonáva hodinu po zavedení činidiel.
Pri hodnotení výsledku je potrebné vziať do úvahy, že predĺžená kultivácia skúmaných mikroorganizmov (viac ako tri dni) vedie k okysleniu média, čo môže viesť k nesprávnemu výsledku štúdie. Reakcia môže byť mierne pozitívna respfalošne negatívny.
Požiadavky na testovacie činidlá
Voges-Proskauerove reagencie musia spĺňať požiadavky ako správna koncentrácia, vysoká čistota a stabilita, čo sa dosahuje správnym skladovaním.
Testovacie súpravy pripravené na použitie zvyčajne obsahujú činidlá na 100 alebo viac použití a dodávajú sa v plastových alebo tónovaných sklenených fľaštičkách. Kvalita je regulovaná príslušnou dokumentáciou.
