Bunková kultúra veľmi závisí od podmienok. Líšia sa pre každý typ bunky, ale zvyčajne pozostávajú z vhodnej nádoby so substrátom alebo médiom, ktoré poskytuje potrebné živiny (aminokyseliny, sacharidy, vitamíny, minerály), rastové faktory, hormóny a plyny (CO2, O2) a reguluje fyzikálne -chemické prostredie (pH pufra, osmotický tlak, teplota). Väčšina buniek vyžaduje povrchový alebo umelý substrát (adhezívna alebo monovrstvová kultúra), zatiaľ čo iné sa môžu voľne množiť v kultivačnom médiu (suspenzná kultúra). Životnosť väčšiny buniek je určená geneticky, ale niektoré bunkové kultúry boli premenené na nesmrteľné bunky, ktoré sa budú množiť donekonečna, ak sa vytvoria optimálne podmienky.
Definícia
Sdefinícia je tu veľmi jednoduchá. V praxi sa výraz "bunková kultúra" teraz vzťahuje na kultiváciu buniek odvodených z mnohobunkových eukaryotov, najmä živočíšnych buniek, na rozdiel od iných typov kultúr. Historický vývoj a kultivačné metódy úzko súvisia s tkanivovou a orgánovou kultúrou. Vírusová kultúra je tiež spojená s bunkami ako hostiteľmi pre vírusy.
História
Laboratórne techniky na získavanie a kultiváciu buniek oddelených z pôvodného tkanivového zdroja sa stali robustnejšími v polovici 20. storočia. Hlavné objavy v tejto oblasti urobili vedci z Yale University.
Prelom v polovici storočia
Pôvodne sa získavanie a kultivácia buniek praktizovala s cieľom nájsť všeliek na mnohé nebezpečné vírusy. Množstvo vedcov zistilo, že mnohé kmene vírusov môžu bezpečne žiť, prosperovať a množiť sa na umelo pestovaných živočíšnych bunkách alebo dokonca celých orgánoch, ktoré sú autonómne držané v špeciálnych fľašiach. Na takéto testy sa spravidla používajú bunky orgánov zvierat, ktoré sú čo najbližšie k ľuďom - napríklad vyšších primátov, ako sú šimpanzy. Všetky tieto objavy boli urobené v 40. rokoch 20. storočia, keď boli experimenty na ľuďoch z určitých dôvodov najrelevantnejšie.
Metodológia
Bunky možno izolovať z tkanív na kultiváciu ex vivo niekoľkými spôsobmi. Môžu sa ľahko zbaviť krvi, ale iba biele krvinky sú schopné rásť v kultúre. Bunky môžubyť izolované z pevných tkanív štiepením extracelulárnej matrice pomocou enzýmov, ako je kolagenáza, trypsín alebo pronáza pred pretrepaním tkaniva, aby sa bunky uvoľnili do suspenzie. Alternatívne môžu byť kúsky tkaniva umiestnené do rastového média a bunky, ktoré rastú, sú dostupné na kultiváciu. Táto metóda je známa ako kultivácia explantátov.
Bunky, ktoré sú kultivované priamo od subjektu, sú známe ako primárne bunky. S výnimkou niektorých pochádzajúcich z nádorov má väčšina primárnych bunkových kultúr obmedzenú životnosť.
Nesmrteľní a kmeňové bunky
Zavedená alebo imortalizovaná bunková línia získala schopnosť neobmedzenej reprodukcie, buď náhodnou mutáciou alebo zámernou modifikáciou, ako je umelá expresia telomerázového génu. Ako typické bunkové typy sú dobre známe početné bunkové línie.
Hromadná kultivácia živočíšnych bunkových línií je základom výroby vírusových vakcín a iných biotechnologických produktov. Kultúra ľudských kmeňových buniek sa používa na rozšírenie ich počtu a diferenciáciu buniek na rôzne typy vhodné na transplantáciu. Kultúra ľudských (kmeňových) buniek sa tiež používa na zber molekúl a exozómov uvoľnených kmeňovými bunkami na terapeutické účely.
Spojenie s genetikou
Biologické produkty vyrobené technológiou rekombinantnej DNA (rDNA) v živočíšnych kultúrach zahŕňajúenzýmy, syntetické hormóny, imunobiologické (monoklonálne protilátky, interleukíny, lymfokíny) a protirakovinové látky. Zatiaľ čo mnoho jednoduchších proteínov možno vyrobiť pomocou rDNA v bakteriálnych kultúrach, zložitejšie proteíny, ktoré sú glykozylované (modifikované sacharidmi), sa v súčasnosti musia vyrábať v živočíšnych bunkách.
Významným príkladom takéhoto komplexného proteínu je hormón erytropoetín. Náklady na pestovanie bunkových kultúr cicavcov sú vysoké, preto prebieha výskum na vytvorenie takýchto komplexných proteínov v bunkách hmyzu alebo vo vyšších rastlinách. Jednou z aplikácií je použitie jednotlivých embryonálnych buniek a somatických embryí ako zdroja priameho prenosu génov bombardovaním časticami, expresiou prechodných génov a konfokálnou mikroskopiou. Kultúra rastlinných buniek je najbežnejšou formou tohto postupu.
Tkanivové kultúry
Tkanivová kultúra je kultivácia tkanív alebo buniek oddelených od organizmu. Tento proces je zvyčajne uľahčený použitím kvapalného, polotuhého alebo pevného rastového média, ako je bujón alebo agar. Tkanivová kultúra vo všeobecnosti označuje kultúru živočíšnych buniek a tkanív, pričom konkrétnejší termín sa používa pre rastliny, rastlinné bunky a tkanivové kultúry. Termín „tkanivová kultúra“zaviedol americký patológ Montrose Thomas Burroughs.
História tkanivovej kultúry
V roku 1885 Wilhelm Roux odstránil časť drenemisky fetálneho kurčaťa a udržiavali ho v teplom soľnom roztoku niekoľko dní, čím sa stanovil základný princíp tkanivovej kultúry. V roku 1907 zoológ Ross Granville Harrison demonštroval rast embryonálnych žabích buniek, ktoré viedli k vzniku nervových buniek v zrazenej lymfe. V roku 1913 E. Steinhardt, C. Israel a R. A. Lambert kultivovali vírus vakcínie vo fragmentoch tkaniva rohov morčiat. Už to bolo niečo oveľa pokročilejšie ako kultúra rastlinných buniek.
Z minulosti do budúcnosti
Gotlieb Haberlandt ako prvý poukázal na možnosť kultivácie izolovaných rastlinných pletív. Navrhol, že táto metóda by mohla určiť schopnosti jednotlivých buniek prostredníctvom tkanivovej kultúry, ako aj vzájomné ovplyvňovanie tkanív na seba. Keď boli pôvodné Haberlandove tvrdenia realizované, začali sa aktívne uplatňovať techniky tkanivových a bunkových kultúr, čo viedlo k novým objavom v biológii a medicíne. Jeho pôvodná myšlienka, predstavená v roku 1902, sa volala totipotencialita: "Teoreticky sú všetky rastlinné bunky schopné produkovať kompletnú rastlinu." Kultivácia bunkových kultúr v tom čase dramaticky pokročila.
V modernom používaní sa tkanivová kultúra vo všeobecnosti vzťahuje na rast buniek z tkaniva mnohobunkového organizmu in vitro. Podmienky bunkovej kultúry nie sú v tomto prípade veľmi dôležité. Tieto bunky môžu byť izolované z darcovského organizmu, primárnych buniek alebo imortalizovanej bunkovej línie. Bunky sa umývajúkultivačné médium, ktoré obsahuje živiny a zdroje energie potrebné na ich prežitie. Termín „tkanivová kultúra“sa často používa zameniteľne s kultúrou buniek.
Aplikácia
Doslovný význam tkanivovej kultúry sa týka kultivácie kúskov tkaniva, t.j. kultúry explantátov.
Tkanivová kultúra je dôležitým nástrojom na štúdium biológie buniek mnohobunkových organizmov. Poskytuje in vitro model tkaniva v dobre definovanom prostredí, s ktorým možno ľahko manipulovať a analyzovať.
V živočíšnych tkanivových kultúrach môžu byť bunky pestované ako 2D monovrstvy (konvenčná kultúra) alebo vo vláknitých skeletoch alebo géloch, aby sa dosiahli prirodzenejšie 3D štruktúry podobné tkanivu (3D kultúra). Eric Simon v správe o grante NIH SBIR z roku 1988 ukázal, že elektrostatické zvlákňovanie by sa mohlo použiť na výrobu lešení z polymérnych vlákien v nano- a submikrónovej mierke špeciálne navrhnutých na použitie ako bunkové a tkanivové substráty in vitro.
Toto skoré použitie elektricky vodivých vláknitých mriežok na bunkovú kultúru a tkanivové inžinierstvo ukázalo, že rôzne typy buniek priľnú a množia sa na polykarbonátových vláknach. Bolo pozorované, že na rozdiel od sploštenej morfológie, ktorá sa zvyčajne pozoruje v 2D kultúre, bunky pestované na vláknach elektrického kábla vykazujú zaoblenejšiu 3D morfológiu, ktorá sa zvyčajne pozoruje v tkanivách in vivo.
Kultúranajmä rastlinné tkanivo sa spája s pestovaním celých rastlín z malých kúskov rastlinných vlákien pestovaných v médiu.
Rozdiely v modeloch
Výskum v oblasti tkanivového inžinierstva, kmeňových buniek a molekulárnej biológie primárne zahŕňa pestovanie bunkových kultúr na plochých plastových miskách. Táto metóda je známa ako dvojrozmerná (2D) bunková kultúra a prvýkrát ju vyvinul Wilhelm Roux, ktorý v roku 1885 odstránil časť medulárnej platne embryonálneho kurčaťa a niekoľko dní ju ponechal v teplom fyziologickom roztoku na plochom skle.
Z pokroku v technológii polymérov sa objavila moderná štandardná plastová miska na dvojrozmernú kultiváciu buniek, bežne známa ako Petriho miska. Julius Richard Petri, nemecký bakteriológ, ktorý sa vo vedeckej literatúre zvyčajne považuje za vynálezcu tohto vynálezu, pracoval ako asistent Roberta Kocha. Dnes rôzni výskumníci tiež používajú kultivačné banky, kužele a dokonca aj jednorazové vrecká, aké sa používajú v jednorazových bioreaktoroch.
Okrem kultivácie dobre etablovaných imortalizovaných bunkových línií môžu byť bunky z primárnych explantátov mnohých organizmov kultivované počas obmedzeného časového obdobia, kým sa neobjaví citlivosť. Kultivované primárne bunky boli široko používané vo výskume, ako v prípade keratocytov rýb v štúdiách bunkovej migrácie. Bunkové kultivačné médiá môžu byť použité vo väčšineiný.
Rastlinné bunkové kultúry sa zvyčajne pestujú ako bunkové suspenzné kultúry v tekutých médiách alebo v kalusových kultúrach na pevnom médiu. Kultúra nediferencovaných rastlinných buniek a kalusov si vyžaduje správnu rovnováhu rastlinných rastových hormónov auxínu a cytokinínu.
