Molekulárne biologické výskumné metódy zohrávajú veľkú úlohu v modernej medicíne, forenznej a biológii. Vďaka pokroku v štúdiu DNA a RNA je človek schopný študovať genóm organizmu, určiť pôvodcu choroby, rozpoznať požadovanú nukleovú kyselinu v zmesi kyselín atď.
Molekulárne biologické výskumné metódy. Čo je to?
V 70. a 80. rokoch sa vedcom po prvý raz podarilo rozlúštiť ľudský genóm. Táto udalosť dala impulz rozvoju genetického inžinierstva a molekulárnej biológie. Štúdium vlastností DNA a RNA viedlo k tomu, že teraz je možné použiť tieto nukleové kyseliny na diagnostikovanie choroby, štúdium génov.
Získanie DNA a RNA
Molekulárne biologické diagnostické metódy vyžadujú prítomnosť východiskového materiálu: častejšie sú to nukleové kyseliny. Existuje niekoľko spôsobov, ako tieto látky izolovať z buniek živých organizmov. Každý z nich má svoje výhody a nevýhody a je potrebnývziať do úvahy pri výbere metódy izolácie čistých nukleových kyselín.
1. Získanie DNA podľa Marmura. Metóda spočíva v ošetrení zmesi látok alkoholom, v dôsledku čoho sa vyzráža čistá DNA. Nevýhodou tejto metódy je použitie agresívnych látok: fenol a chloroform.
2. Izolácia DNA podľa Booma. Hlavnou látkou, ktorá sa tu používa, je guanidíntiokyanát (GuSCN). Prispieva k vyzrážaniu kyseliny deoxyribonukleovej na špecializovaných substrátoch, z ktorých ju možno následne zbierať pomocou špeciálneho pufra. GuSCN je však inhibítor PTC a aj jeho malá časť, ktorá sa dostane do vyzrážanej DNA, môže ovplyvniť priebeh polymerázovej reťazovej reakcie, ktorá hrá dôležitú úlohu pri práci s nukleovými kyselinami.
3. Sedimentácia nečistôt. Metóda sa od predchádzajúcich líši tým, že sa nezrážajú molekuly kyseliny deoxyribonukleovej, ale nečistoty. Na tento účel sa používajú iónomeniče. Nevýhodou je, že nie všetky látky sa môžu vyzrážať.
4. Hromadné premietanie. Táto metóda sa používa v prípadoch, keď nie sú potrebné presné informácie o zložení molekuly DNA, ale je potrebné získať nejaké štatistické údaje. To je vysvetlené skutočnosťou, že štruktúra nukleovej kyseliny môže byť poškodená pri ošetrení detergentmi, najmä zásadami.
Klasifikácia výskumných metód
Všetky metódy molekulárneho biologického výskumu sú rozdelené do troch veľkých skupín:
1. Amplifikácia (pomocou mnohých enzýmov). Tuoznačuje PCR - polymerázovú reťazovú reakciu, ktorá hrá veľkú úlohu v mnohých diagnostických metódach.
2. Nezosilňujúce. Táto skupina metód priamo súvisí s prevádzkou zmesí nukleových kyselín. Príkladmi sú 3 bloty, hybridizácia in situ atď.
3. Metódy založené na rozpoznávaní signálu z molekuly sondy, ktorá sa viaže na špecifickú sondu DNA alebo RNA. Príkladom je Hybride Capture System (hc2).
Enzýmy, ktoré možno použiť v metódach molekulárnej biológie
Mnohé molekulárne diagnostické metódy zahŕňajú použitie širokého spektra enzýmov. Nižšie sú najčastejšie používané:
1. Reštrikčný enzým - "rozreže" molekulu DNA na potrebné časti.
2. DNA polymeráza – syntetizuje dvojvláknovú molekulu kyseliny deoxyribonukleovej.
3. Reverzná transkriptáza (revertáza) – používa sa na syntézu DNA na šablóne RNA.
4. DNA ligáza – zodpovedná za tvorbu fosfodiesterových väzieb medzi nukleotidmi.
5. Exonukleáza – odstraňuje nukleotidy z koncových častí molekuly deoxyribonukleovej kyseliny.
PCR je hlavná metóda amplifikácie DNA
Polymerázová reťazová reakcia (PCR) sa aktívne používa v modernej molekulárnej biológii. Ide o metódu, pri ktorej je možné získať obrovské množstvo kópií z jednej molekuly DNA (molekuly sú amplifikované).
Hlavné funkcie PCR:
- diagnostikachoroby;
- klonovanie DNA segmentov, génov.
Na uskutočnenie polymerázovej reťazovej reakcie sú potrebné nasledujúce prvky: počiatočná molekula DNA, termostabilná DNA polymeráza (Taq alebo Pfu), deoxyribonukleotidové fosfáty (zdroje dusíkatých báz), priméry (2 priméry na 1 molekulu DNA) a samotný nárazníkový systém, v ktorom sú možné všetky reakcie.
PCR pozostáva z troch krokov: denaturácia, žíhanie primérov a predĺženie.
1. Denaturácia. Pri teplote 94-95 stupňov Celzia sa vodíkové väzby medzi dvoma vláknami DNA prerušia a výsledkom sú dve jednovláknové molekuly.
2. Žíhanie základného náteru. Pri teplote 50-60 stupňov Celzia sa priméry pripájajú na konce molekúl jednovláknovej nukleovej kyseliny podľa typu komplementarity.
3. Predĺženie. Pri teplote 72 stupňov dochádza k syntéze dcérskych dvojvláknových molekúl deoxyribonukleovej kyseliny.
Sekvenovanie DNA
Molekulárne biologické metódy výskumu často vyžadujú znalosť nukleotidovej sekvencie v molekule deoxyribonukleovej kyseliny. Na určenie genetického kódu sa vykonáva sekvenovanie. Molekulárna diagnostika budúcnosti bude založená na poznatkoch získaných ľudským sekvenovaním.
Rozlišujú sa nasledujúce typy sekvencovania:
- Maxam-Gilbertovo sekvenovanie;
- Sangerove sekvenovanie;
- pyrosequencing;
- nanoporesekvenovanie.
