Na rozdiel od eukaryotov baktérie nemajú vytvorené jadro, ale ich DNA nie je rozptýlená po celej bunke, ale je sústredená v kompaktnej štruktúre nazývanej nukleoid. Z funkčného hľadiska ide o funkčný analóg jadrového zariadenia.
Čo je nukleoid
Bakteriálny nukleoid je oblasť v ich bunkách, ktorá obsahuje štruktúrovaný genetický materiál. Na rozdiel od eukaryotického jadra nie je oddelené membránou od zvyšku bunkového obsahu a nemá stály tvar. Napriek tomu je genetický aparát baktérií jasne oddelený od cytoplazmy.
Samotný výraz znamená „podobný jadru“alebo „jadrová oblasť“. Túto štruktúru prvýkrát objavil v roku 1890 zoológ Otto Buchli, no jej odlišnosti od genetického aparátu eukaryotov boli identifikované už začiatkom 50. rokov 20. storočia vďaka technológii elektrónovej mikroskopie. Názov „nukleoid“zodpovedá konceptu „bakteriálneho chromozómu“, ak je bakteriálny chromozóm obsiahnutý v bunke v jedinej kópii.
Nukleoid nezahŕňa plazmidy, ktorésú extrachromozomálne prvky bakteriálneho genómu.
Vlastnosti bakteriálneho nukleoidu
Nukleoid zvyčajne zaberá centrálnu časť bakteriálnej bunky a je orientovaný pozdĺž svojej osi. Objem tohto kompaktného útvaru nepresahuje 0,5 mikrónu3 a molekulová hmotnosť kolíše od 1×109 do 3×109 d alton. V určitých bodoch je nukleoid naviazaný na bunkovú membránu.
Bakteriálny nukleoid obsahuje tri zložky:
- DNA.
- Štrukturálne a regulačné proteíny.
- RNA.
DNA má chromozomálnu organizáciu, ktorá sa líši od eukaryotickej. Bakteriálny nukleoid najčastejšie obsahuje jeden chromozóm alebo niekoľko jeho kópií (s aktívnym rastom ich počet dosahuje 8 alebo viac). Tento indikátor sa mení v závislosti od typu a štádia životného cyklu mikroorganizmu. Niektoré baktérie majú viacero chromozómov s rôznymi súbormi génov.
V strede nukleoidu je DNA zbalená celkom tesne. Táto zóna je neprístupná pre ribozómy, replikačné a transkripčné enzýmy. Naopak, deoxyribonukleové slučky periférnej oblasti nukleoidu sú v priamom kontakte s cytoplazmou a predstavujú aktívne oblasti bakteriálneho genómu.
Množstvo proteínovej zložky v bakteriálnom nukleoide nepresahuje 10 %, čo je asi 5-krát menej ako v eukaryotickom chromatíne. Väčšina proteínov je spojená s DNA a podieľa sa na jej štruktúrovaní. RNA je produkttranskripcia bakteriálnych génov, ktorá sa uskutočňuje na periférii nukleoidu.
Genetický aparát baktérií je dynamická formácia schopná meniť svoj tvar a štrukturálnu konformáciu. Chýbajú mu jadierka a mitotický aparát charakteristický pre jadro eukaryotickej bunky.
Bakteriálny chromozóm
Vo väčšine prípadov majú bakteriálne nukleoidné chromozómy tvar uzavretého prstenca. Lineárne chromozómy sú oveľa menej bežné. V každom prípade tieto štruktúry pozostávajú z jedinej molekuly DNA, ktorá obsahuje súbor génov potrebných na prežitie baktérií.
Chromozomálna DNA je dokončená vo forme supercoiled slučiek. Počet slučiek na chromozóm sa pohybuje od 12 do 80. Každý chromozóm je plnohodnotným replikónom, pretože pri zdvojení sa DNA úplne skopíruje. Tento proces vždy začína od začiatku replikácie (OriC), ktorý je pripojený k plazmatickej membráne.
Celková dĺžka molekuly DNA v chromozóme je o niekoľko rádov väčšia ako veľkosť baktérie, takže je potrebné ju zbaliť, no pri zachovaní funkčnej aktivity.
V eukaryotickom chromatíne tieto úlohy vykonávajú hlavné proteíny – históny. Bakteriálny nukleoid obsahuje proteíny viažuce DNA, ktoré sú zodpovedné za štrukturálnu organizáciu genetického materiálu a tiež ovplyvňujú génovú expresiu a replikáciu DNA.
Proteíny spojené s nukleoidmi zahŕňajú:
- proteíny podobné histónu HU, H-NS, FIS a IHF;
- topoizomerázy;
- proteíny z rodiny SMC.
Posledné 2 skupiny majú najväčší vplyv na supercoiling genetického materiálu.
Neutralizáciu negatívnych nábojov chromozomálnej DNA vykonávajú polyamíny a horčíkové ióny.
Biologická úloha nukleoidu
V prvom rade je nukleoid potrebný pre baktérie na ukladanie a prenos dedičných informácií, ako aj na ich implementáciu na úrovni bunkovej syntézy. Inými slovami, biologická úloha tejto formácie je rovnaká ako úloha DNA.
Ďalšie funkcie bakteriálnych nukleoidov zahŕňajú:
- lokalizácia a zhutnenie genetického materiálu;
- funkčné balenie DNA;
- regulácia metabolizmu.
Štruktúrovanie DNA nielenže umožňuje molekule zapadnúť do mikroskopickej bunky, ale vytvára aj podmienky pre normálny tok replikačných a transkripčných procesov.
Vlastnosti molekulárnej organizácie nukleoidu vytvárajú podmienky pre riadenie bunkového metabolizmu zmenou konformácie DNA. Regulácia nastáva tak, že sa určité časti chromozómu premiestnia do cytoplazmy, čo ich sprístupní pre transkripčné enzýmy alebo naopak, ich vtiahnutím dovnútra.
Metódy detekcie
Existujú 3 spôsoby, ako vizuálne odhaliť nukleoid v baktériách:
- svetelná mikroskopia;
- fázová kontrastná mikroskopia;
- elektrónová mikroskopia.
V závislosti od metódypríprava prípravku a výskumná metóda, nukleoid môže vyzerať inak.
Svetelná mikroskopia
Na detekciu nukleoidu pomocou svetelného mikroskopu sa baktérie predbežne zafarbia, aby mal nukleoid inú farbu ako zvyšok bunkového obsahu, inak nebude táto štruktúra viditeľná. Na podložné sklíčko je tiež povinné fixovať baktérie (v tomto prípade odumierajú mikroorganizmy).
Cez šošovku svetelného mikroskopu vyzerá nukleoid ako útvar v tvare fazule s jasnými hranicami, ktorý zaberá centrálnu časť bunky.
Spôsoby farbenia
Vo väčšine prípadov sa na vizualizáciu nukleoidu pomocou svetelnej mikroskopie používajú nasledujúce metódy farbenia baktérií:
- podľa Romanovského-Giemsa;
- Felgenova metóda.
Pri farbení podľa Romanovského-Giemsa sa baktérie vopred fixujú na podložné sklíčko metylalkoholom a potom sa 10-20 minút impregnujú farbivom z rovnakej zmesi azúru, eonínu a metylénovej modrej rozpustený v metanole. Výsledkom je, že nukleoid sa stáva fialovým a cytoplazma sa stáva svetloružovou. Pred mikroskopovaním sa škvrna vysuší a sklíčko sa premyje destilátom a vysuší.
Feulgenova metóda využíva slabo kyslú hydrolýzu. Výsledkom je, že uvoľnená deoxyribóza prechádza do aldehydovej formy a interaguje s fuchzínovou kyselinou sírovou Schiffovho činidla. Výsledkom je, že nukleoid sa zmení na červený a cytoplazma na modrú.
Fázová kontrastná mikroskopia
Fázová kontrastná mikroskopia mávyššie rozlíšenie ako svetlo. Táto metóda nevyžaduje fixáciu a farbenie prípravku – pozorovanie prebieha na živé baktérie. Nukleoid v takýchto bunkách vyzerá ako svetlá oválna oblasť na pozadí tmavej cytoplazmy. Efektívnejšiu metódu je možné dosiahnuť aplikáciou fluorescenčných farbív.
Detekcia nukleoidov pomocou elektrónového mikroskopu
Existujú 2 spôsoby prípravy prípravku na vyšetrenie nukleoidov pod elektrónovým mikroskopom:
- ultratenký strih;
- Zrežte mrazené baktérie.
Na elektrónových mikrosnímkach ultratenkého rezu baktérie má nukleoid vzhľad hustej sieťovej štruktúry pozostávajúcej z tenkých vlákien, ktorá vyzerá ľahšie ako okolitá cytoplazma.
Na reze zmrazenej baktérie po imunofarbení vyzerá nukleoid ako koralovitá štruktúra s hustým jadrom a tenkými výbežkami prenikajúcimi do cytoplazmy.
Na elektronických fotografiách zaberá nukleoid baktérií najčastejšie centrálnu časť bunky a má menší objem ako v živej bunke. Je to kvôli vystaveniu chemikáliám používaným na fixáciu prípravku.
