Mikroorganizmy v prírode okolo nás sú všade: v pôdach, vodných útvaroch, na povrchoch rôznych predmetov, sú nimi obývaní ľudia a zvieratá. To všetko môže slúžiť ako zdroj mikrobiálnej kontaminácie potravín, liekov a výrobných liniek. Kultivácia baktérií je potrebná na štúdium ich vlastností, potrieb a charakteristík. To je zase dôležitý krok vo vývoji rôznych liekov, laboratórnej diagnostike chorôb, výpočte výrobných reaktorov a oveľa viac.
Všeobecné pojmy
Kultivácia baktérií v mikrobiológii znamená kultiváciu mikroorganizmov uskutočňovanú v laboratóriu. Na druhej strane, mikróby, ktoré vyrástli na vybranom živnom médiu, sa nazývajú kultúra. Kultúry môžu byť zmiešané, ak sú tvorené rôznymi typmi mikroorganizmov, a čisté, ak sú zastúpené iba jedným typom baktérií.
Ak ide o výživuV médiu je umiestnená iba jedna bunka a ako výsledok jej reprodukcie sa získa skupina jedincov, potom sa tento súbor mikroorganizmov nazýva klon. Keď sa klon vyvinie do bodu, kedy sa stane viditeľným voľným okom, táto zbierka baktérií sa nazýva kolónia.
Pestovanie baktérií izolovaných z rôznych zdrojov sa zvyčajne uskutočňuje oddelene od seba. Každá takáto samostatne pestovaná skupina mikróbov sa nazýva kmeň. Ak je teda jeden typ stafylokoka izolovaný z troch zdrojov (alebo rôznych častí toho istého produktu, rôznych ľudí), hovorí sa o troch kmeňoch tohto typu stafylokoka.
Rastové faktory baktérií
Sem patria rôzne aminokyseliny, lipidy, purínové bázy a ďalšie zlúčeniny potrebné pre vývoj mikroorganizmov. Niektoré mikróby môžu nezávisle produkovať látky, ktoré potrebujú, zatiaľ čo iné ich potrebujú prijímať v hotovej forme. Podľa potrieb mikroorganizmov v určitých rastových faktoroch sa uskutočňuje identifikácia a diferenciácia baktérií. Tento parameter je dôležitý aj pre správnu prípravu živnej pôdy pre laboratórne a biotechnologické práce:
- Aminokyseliny. Baktérie môžu vyžadovať jednu konkrétnu aminokyselinu alebo skupinu kyselín. Takže klostrídie potrebujú leucín a tyrozín, streptokoky potrebujú leucín a arginín. Mikroorganizmy, ktoré na svoj rast potrebujú aminokyseliny zvonku, sa nazývajú auxotrofy.
- Purínové a pyrimidínové zásady, ako aj ich deriváty (adenín, guanín a iné). Sú dôležitým faktorom rastu mnohýchDruh Streptococcus.
- Vitamíny. Sú súčasťou koenzýmov potrebných pre baktérie. Takže kyselinu nikotínovú, ako aj jej amid, ktoré sú súčasťou NAD a NADP, potrebujú korynebaktérie záškrtu a shigella. Tiamín, ako integrálnu súčasť pyrofosfátu, vyžadujú Staphylococcus aureus, pneumokoky, brucella. Kyselinu pantoténovú, ktorá je súčasťou koenzýmu CoA, vyžadujú tetanové bacily a niektoré druhy streptokokov. Cytochrómy, a teda kyselina listová, hemy a biotín, ktoré ich tvoria, sú nevyhnutné pre Mycobacterium tuberculosis a Haemophilus influenzae.
Požiadavky na životné prostredie
Podmienky pre kultivačné médiá na kultiváciu baktérií:
- Výživa. Musia obsahovať látky, navyše v ľahko stráviteľnej forme, potrebné pre mikroorganizmy na výživu a doplnenie energie. Patria sem organogény a minerály. Niektoré mikroorganizmy navyše vyžadujú vitamíny a aminokyseliny, ktoré si nedokážu syntetizovať.
- Optimálna úroveň pH. Ovplyvňuje priepustnosť bunkovej membrány a tým aj schopnosť baktérie absorbovať živiny. Najčastejšie by mala byť hodnota pH na úrovni 7, 2–7, 4. Mnohé mikroorganizmy v priebehu života produkujú produkty s kyslými alebo zásaditými reakciami a aby sa pH živného média nezmenilo, napr. musí byť vo vyrovnávacej pamäti.
- Izotonický. Osmotický tlak v živnom médiu na kultiváciu baktérií by mal mať rovnaké hodnoty akovnútri mikrobiálnych buniek. Zvyčajne zodpovedá 0,5 % roztoku NaCl.
- Sterilita. Dôvodom je skutočnosť, že výskyt cudzích baktérií skreslí výsledky štúdie analyzovaného kmeňa.
- Úroveň vlhkosti. Tento indikátor spolu s konzistenciou média by mal mať optimálne vlastnosti pre konkrétny typ baktérií.
- Redoxný potenciál (RH2). Ukazuje pomer látok, ktoré darujú a prijímajú elektróny, ako aj úroveň nasýtenia živného média kyslíkom. V prípade aeróbov a anaeróbov sa podmienky na kultiváciu baktérií v tomto ukazovateli trochu líšia. Anaeróbne mikroorganizmy sa najlepšie reprodukujú pri hodnotách RH2 pod 5 a aeróbne mikroorganizmy aspoň 10.
- Jednotnosť. Je dôležité, aby kultivačné médium obsahovalo konštantné množstvá jednotlivých zložiek. Okrem toho sa uprednostňujú číre roztoky, ktoré uľahčujú sledovanie rastu plodín alebo zaznamenanie kontaminácie.
Typy kultivačných médií
Výber konkrétneho média na pestovanie mikroorganizmov je ovplyvnený mnohými faktormi, medzi ktoré patrí charakteristika ich výživy a účel štúdie. Hlavné znaky klasifikácie živných médií sú:
1. Komponenty. Podľa východiskových látok použitých na vytvorenie substrátu rozlišujú:
- natural, ktoré sa pripravujú z produktov živočíšneho alebo rastlinného pôvodu (napr. mäso, mlieko, ovocie) a sú vhodné na pestovanie zmiešanýchplodiny;
- polosyntetické, v ktorých sú drahé prírodné potravinové produkty nahradené nepotravinovými produktmi (napríklad kostná múčka, krvné zrazeniny) a ktoré sú optimálne na kultiváciu niektorých druhov baktérií alebo izoláciu ich metabolických produktov od prostredie;
- syntetické, ktoré sa pripravujú z presných množstiev chemických zlúčenín, majú známe konštantné zloženie a sú ľahko reprodukovateľné.
2. Konzistencia (hustota). Rozlišujte prostredia:
- liquid;
- dense;
- polotekuté.
Posledné dva sa pripravujú zo špeciálnych roztokov alebo tekutých látok s prídavkom agar-agaru alebo želatíny na vytvorenie požadovanej hustoty. Okrem toho je hustým prostredím pre rast baktérií zrazené krvné sérum, zemiaky, silikagélové médiá, karagén.
3. Zlúčenina. Na tomto základe sú prostredia:
- jednoduché, ktorých zoznam je krátky, je mäsový peptónový vývar (MBB), hottingerský vývar a agar, mäsový peptónový agar (MPA), výživná želatína a peptónová voda.
- komplex, pripravený z jednoduchých s prídavkom krvi, srvátky, sacharidov a iných látok.
4. Vymenovanie. Rozlišujú sa tieto živné médiá:
- main sa používajú na pestovanie mnohých patogénnych mikróbov (zvyčajne jednoduché zloženie);
- špeciálne sa používajú na izoláciu a kultiváciu baktérií, ktoré nerastú na jednoduchých substrátoch;
- selektívne (sú aj selektívne) sú vhodné na izoláciu špecifického typu baktérií a inhibujú rast asociovaných mikróbov (selektivitavytvorené pridaním určitých látok do média, ako sú antibiotiká alebo soli, alebo úpravou pH);
- diferenciálna diagnostika umožňuje rozlíšiť jeden typ baktérií od druhého posúdením enzymatickej aktivity, napríklad média;
- konzervačné látky sú potrebné na počiatočnú inokuláciu s následným transportom vzoriek, pretože zabraňujú smrti mikroorganizmov, ako aj inhibujú rast iných baktérií.
Príprava médií
Najdôležitejším krokom pri kultivácii anaeróbnych baktérií je príprava vhodného živného média. Po výbere optimálnych parametrov prejdite na nasledujúce kroky:
- váženie výberom vzorky komponentov na analytických váhach;
- rozpúšťanie sa uskutočňuje v destilovanej vode zohriatej na 70 °C a oddelene sa rozpúšťajú fosforečnany, mikro- a makrosoli;
- varenie vo vodnom kúpeli dve minúty;
- určenie pH pomocou indikačného papierika alebo potenciometra;
- filtrácia cez mokrú tkaninu alebo papierové filtre pre tekuté aj roztavené husté médiá a cez filter z bavlnenej gázy pre agarové médiá;
- plnenie do fliaš na 3/4 kapacity;
- stredne závislá sterilizácia;
- kontrola sterility sa vykonáva usadzovaním na dva dni v termostate, po ktorom nasleduje prezeranie;
- chemická kontrola na stanovenie pH a potrebného obsahupoložky;
- biologická kontrola skúšobným očkovaním.
Sterilizácia skla a médií
Jedným zo základných princípov kultivácie baktérií je sterilita. Rast a vývoj cudzích mikroorganizmov môže ovplyvniť vlastnosti živného média zmenou jeho chemického zloženia a pH. Sterilizácia je hlavnou podmienkou pestovania čistých kultúr. V praxi tento pojem znamená spôsoby ničenia absolútne všetkých foriem života na povrchu a v objeme sterilizovaných predmetov. Nádoby, použité nástroje, médiá a ďalšie položky používané počas štúdie sú sterilizované.
Niektoré typy sterilizácie:
- Zapaľovanie. Sterilizáciu slučiek a ihiel na siatie, podložné sklíčka, niektoré nástroje je možné vykonať pomocou horáka alebo liehovej lampy.
- Varenie. Vhodné na manipuláciu so striekačkami, ihlami, potravinami, ale nezabíja bakteriálne spóry.
- Sterilizácia suchým teplom. Vykonáva sa v špeciálnej sušiarni a je vhodná na spracovanie baniek, skúmaviek a iného laboratórneho skla.
- Sterilizácia parou. Táto metóda, ktorá sa vykonáva v autokláve, je vysoko účinná. Nie je však vhodný pre živné pôdy obsahujúce bielkoviny alebo iné zlúčeniny, ktoré sa rozkladajú pri vysokých teplotách. Šetrenie možno nazvať tyndalizáciou. Vykonáva sa v kotli Koch a spája klíčenie spór s ich zničením.
- Pasterizácia. Používa sa pre médiá, ktoré pri varení menia svoje vlastnosti (napríklad mlieko, víno, pivo), schopnézbavte ich mikroorganizmov, ktoré nenesú spóry. Teplota spracovania je iba 50-60 °C počas pätnástich až tridsiatich minút. V niektorých prípadoch sa používa sterilizácia za studena, ktorá sa vykonáva pomocou filtrov alebo UV lúčov.
Podmienky kultivácie baktérií
Rast a vývoj baktérií je možný len za určitých faktorov a hodnôt každého z nich:
1. Teplota. Existujú tri skupiny baktérií, ktoré sa líšia v preferenciách teploty:
- termofily alebo teplomilné mikróby rastú pri 45-90°C, čo znamená, že sa nemnožia v ľudských a zvieracích organizmoch;
- psychrofily, čiže chladnomilné mikroorganizmy, preferujú teploty v rozmedzí 5-15°C a pestujú sa v chladiarňach;
- mezofily, vyvíjajú sa pri teplote 25-37 °C, zahŕňajú väčšinu baktérií.
2. Svetlo. Je to znak kultivácie fototrofných baktérií, pretože vykonávajú proces fotosyntézy. Ale pre väčšinu mikróbov nie je osvetlenie podmienkou. A dokonca aj naopak, slnečné ultrafialové žiarenie môže potlačiť ich rozvoj.
3. Voda. Všetky mikroorganizmy potrebujú vodu v dostupnej (tekutej) forme. To je dôvod, prečo sa v mrazených potravinách nemnožia baktérie takmer vôbec.
4. Kyslosť prostredia. Tento princíp kultivácie baktérií už bol podrobne diskutovaný vyššie.
5. Prevzdušňovanie. Kyslík ako chemický prvok je neoddeliteľnou súčasťou vody a značného počtu zlúčenín, ktoré sa na ňu používajúkultivácia mikroorganizmov. Plynný kyslík môže byť obsiahnutý aj vo vode a iných kvapalinách v rozpustenej forme. Významná časť baktérií potrebuje neustály prísun molekúl kyslíka. Ale pre množstvo mikroorganizmov je to zbytočné, v horšom prípade je pre nich plynný kyslík toxický, keďže nemajú katalázu a peroxidázu, ktoré ničia toxické produkty dýchacích ciest. Najdôležitejším krokom pri kultivácii anaeróbnych baktérií je preto odstránenie molekúl O2 zo živného média.
6. Kultivácia mikroorganizmov. Kultivácia aeróbnych a anaeróbnych baktérií sa uskutočňuje v rôznych vrstvách prostredia a v rôznych režimoch.
Kultivácia aeróbnych mikroorganizmov
Pestovanie aeróbnych baktérií vyžaduje molekulárny kyslík. Na získanie čistých kultúr aeróbov, ktoré možno úspešne použiť v medicíne a potravinárskom priemysle, sa používajú tieto metódy:
- povrch rastie na hustom médiu alebo v tekutom médiu (ich tenká vrstva), keď kyslík prichádza priamo zo vzduchu;
- hlboká kultivácia v tekutých médiách, kedy sa neustálym prevzdušňovaním dosahuje zvýšenie množstva v nich rozpusteného kyslíka.
Kultivácia anaeróbnych mikroorganizmov
Základným princípom kultivácie baktérií tohto typu je ich minimálny kontakt so vzdušným kyslíkom. Zabezpečenie podmienok pre ich rast je oveľa náročnejšie ako u aeróbov. Na izoláciu anaeróbov z molekulárnych O2 sa používajú nasledujúce metódy:
- Fyzické. Tento spôsob kultivácie anaeróbnych baktérií sa redukuje na ich kultiváciu v špeciálnom vákuovom prístroji - mikroanaerostate. Vzduch v ňom je nahradený špeciálnou plynovou zmesou dusíka s prídavkom 10% vodíka a 5% oxidu uhličitého.
- Chemický. Tieto zahŕňajú: použitie absorpčných činidiel (napr. Fe, Na2S2O4, CuCl) alebo redukčné činidlá (ako je kyselina askorbová).
- Biologické. Ide o spoločnú kultiváciu aeróbov a anaeróbov v uzavretom systéme. Táto metóda kultivácie baktérií zahŕňa naočkovanie jednej polovice Petriho misky niektorým z aeróbnych druhov baktérií a druhej polovice študovanými anaeróbmi. Jeho vývoj sa začne v momente, keď sa spotrebuje všetok kyslík.
Na kultiváciu anaeróbnych baktérií sú vhodné nasledujúce metódy výsevu:
- v povrchovej vrstve;
- v povrchovej vrstve naplnenej sterilným parafínom;
- v hustej živnej pôde;
- v hlbokých vrstvách viskózneho média.
Získanie čistej kultúry
Mikrobiológovia zvyčajne pracujú so vzorkami obývanými mnohými rôznymi typmi mikróbov. Na určenie systematického postavenia mikroorganizmov (rodina, rod, druh), ako aj na štúdium ich vlastností je však potrebné ich izolovať a pestovať čistú kultúru. Majú veľký význam v mnohých potravinárskych odvetviach, napríklad syr, chlieb, kvas, víno atď. Pestovanie baktérií mliečneho kvasenia umožňuje získaťnevyhnutná zložka na výrobu fermentovaných mliečnych výrobkov, cesta, kakaa, siláže a dokonca aj plastov.
Metóda izolácie čistej kultúry v hustom médiu je založená na mechanickej separácii buniek mikroorganizmov s ich následnou izolovanou kultiváciou. Vzorka sa prenesie do sterilného objemu vody alebo fyziologického roztoku (objem 10-100 ml) a potom sa dve minúty pretrepáva. Aby sa extrahovali mikroorganizmy nachádzajúce sa v hrúbke študovaného materiálu (napríklad klobásy alebo syry), najprv sa vykoná potieranie kúskov vzorky sterilnými nástrojmi pieskom. Materiál, ktorý prešiel predbežnou prípravou, s hmotnosťou 1 g alebo objemom 1 ml, sa zriedi sterilnou vodou 10, 100, 1000 atď. Stupeň riedenia sa volí tak, aby koncentrácia buniek zodpovedala schopnostiam metódy.
Následnou kultiváciou mikroorganizmov je príprava živného média. Zvyčajne sa volí husté médium (MPA). Najprv sa roztopí a ochladí na 45-50 °C a až potom sa naleje do niekoľkých Petriho misiek (tri až päť kusov), na dno ktorých sa umiestnia tampóny z testovanej látky rôznych koncentrácií. Ďalej sa uskutoční premiešanie ešte nezmrznutého živného média a materiálu, ktorý sa doň zavádza. Takto sú bunky fixované v rôznych bodoch objemu substrátu.
Potom sa Petriho misky umiestnia do termostatu na 2 dni pri 22 °C. Počas tejto doby sa bunky rozmnožia do takej miery, že kolónia vytvorená každou z buniek sa stane viditeľnou voľným okom. Každá z nich je čistou kultúrou typu baktérií, z ktorých buniek pochádzaruža.
Potom sa mikroorganizmy z Petriho misiek subkultivujú do samostatných skúmaviek naplnených živným médiom. Týmto spôsobom sa zo zmiešanej vzorky izolujú čisté kultúry. Táto metóda nesie meno svojho vývojára – R. Kocha. Bežne sa nazýva aj pohárová metóda alebo ochudobnená siatie. Po získaní čistých kultúr rôznych typov baktérií sa určí ich tvar, spóry a rodiny.
Všetky práce sa musia vykonávať v súlade so zásadami asepsie. Aby sa predišlo predčasnému vývoju mikroorganizmov, štúdia by sa mala vykonať ihneď po odbere vzoriek. Voda z vodovodu sa analyzuje po vypustení prvých dávok, pretože môžu obsahovať mikróby nahromadené v potrubiach a kohútikoch. Mikroflóra ovocia, bobúľ a zeleniny sa nachádza hlavne na povrchu (kôra), preto sa z nej vykonávajú umývania. Za týmto účelom vložte plod do sterilnej nádoby a naplňte ju požadovaným množstvom vody. Potom sa dosť energicky pretrepú a voda sa naleje do inej nádoby. Plodiny z látkových výrobkov sa získavajú aj v tampónoch, ale predtým sa z nich vyrežú kúsky danej veľkosti.
