Koncept imobilizovaných enzýmov sa prvýkrát objavil v druhej polovici 20. storočia. Medzitým sa v roku 1916 zistilo, že sacharóza sorbovaná na uhlíku si zachovala svoju katalytickú aktivitu. V roku 1953 D. Schleit a N. Grubhofer uskutočnili prvú väzbu pepsínu, amylázy, karboxypeptidázy a RNázy s nerozpustným nosičom. Koncept imobilizovaných enzýmov bol legalizovaný v roku 1971. Stalo sa tak na prvej konferencii o inžinierskej enzymológii. V súčasnosti sa pojem imobilizované enzýmy posudzuje v širšom zmysle, ako tomu bolo na konci 20. storočia. Pozrime sa bližšie na túto kategóriu.
Všeobecné informácie
Imobilizované enzýmy sú zlúčeniny, ktoré sú umelo naviazané na nerozpustný nosič. Zachovávajú si však svoje katalytické vlastnosti. V súčasnosti sa tento proces posudzuje z dvoch hľadísk – v rámci čiastočného a úplného obmedzenia slobody pohybu molekúl bielkovín.
Dignity
Vedci zistili určité výhody imobilizovaných enzýmov. Pôsobia ako heterogénne katalyzátory a môžu sa ľahko oddeliť od reakčného média. V rámci výskumu sa zistilo, že použitie imobilizovaných enzýmov sa môže opakovať. Počas procesu viazania spoje menia svoje vlastnosti. Získavajú substrátovú špecifickosť a stabilitu. Zároveň ich činnosť začína závisieť od podmienok prostredia. Imobilizované enzýmy sú odolné a majú vysoký stupeň stability. Je tisíckrát, desaťtisíckrát väčšia ako napríklad u voľných enzýmov. To všetko zabezpečuje vysokú účinnosť, konkurencieschopnosť a hospodárnosť technológií, v ktorých sú prítomné imobilizované enzýmy.
Media
J. Poratu identifikoval kľúčové vlastnosti ideálnych materiálov, ktoré sa majú použiť pri imobilizácii. Nositelia musia mať:
- Nerozpustnosť.
- Vysoká biologická a chemická odolnosť.
- Schopnosť rýchlej aktivácie. Prepravcovia by sa mali ľahko stať reaktívnymi.
- Významná hydrofilita.
- Potrebná priepustnosť. Jeho indikátor by mal byť rovnako prijateľný pre enzýmy aj koenzýmy, reakčné produkty a substráty.
V súčasnosti neexistuje žiadny materiál, ktorý by plne spĺňal tieto požiadavky. Napriek tomu sa v praxi používajú nosiče, ktoré sú vhodné na imobilizáciu.určitú kategóriu enzýmov za špecifických podmienok.
Klasifikácia
V závislosti od povahy sa materiály, v súvislosti s ktorými sa zlúčeniny premieňajú na imobilizované enzýmy, delia na anorganické a organické. Väzba mnohých zlúčenín sa uskutočňuje pomocou polymérnych nosičov. Tieto organické materiály sú rozdelené do 2 tried: syntetické a prírodné. V každom z nich sa zasa rozlišujú skupiny v závislosti od štruktúry. Anorganické nosiče predstavujú najmä materiály zo skla, keramiky, hliny, silikagélu a grafitovej černe. Pri práci s materiálmi sú obľúbené metódy suchej chémie. Imobilizované enzýmy sa získavajú potiahnutím nosičov filmom z titánu, hliníka, zirkónia, oxidov hafnia alebo spracovaním s organickými polymérmi. Dôležitou výhodou materiálov je ľahká regenerácia.
Proteínové nosiče
Najpopulárnejšie sú lipidové, polysacharidové a proteínové materiály. Medzi poslednými je potrebné zdôrazniť štrukturálne polyméry. Ide predovšetkým o kolagén, fibrín, keratín a želatínu. Takéto proteíny sú široko distribuované v prirodzenom prostredí. Sú cenovo dostupné a ekonomické. Okrem toho majú veľký počet funkčných skupín na väzbu. Proteíny sú biologicky odbúrateľné. To umožňuje rozšíriť využitie imobilizovaných enzýmov v medicíne. Medzitým majú proteíny aj negatívne vlastnosti. Nevýhodami použitia imobilizovaných enzýmov na proteínových nosičoch je ich vysoká imunogenicita, ako ajschopnosť uviesť do reakcií len určité skupiny z nich.
Polysacharidy, aminosacharidy
Z týchto materiálov sa najčastejšie používa chitín, dextrán, celulóza, agaróza a ich deriváty. Aby boli polysacharidy odolnejšie voči reakciám, ich lineárne reťazce sú zosieťované epichlórhydrínom. Do sieťových štruktúr sú voľne zavedené rôzne ionogénne skupiny. Chitín sa hromadí vo veľkých množstvách ako odpad pri priemyselnom spracovaní kreviet a krabov. Táto látka je chemicky odolná a má dobre definovanú poréznu štruktúru.
Syntetické polyméry
Táto skupina materiálov je veľmi rôznorodá a prístupná. Zahŕňa polyméry na báze kyseliny akrylovej, styrénu, polyvinylalkoholu, polyuretánu a polyamidových polymérov. Väčšina z nich je mechanicky odolná. V procese transformácie poskytujú možnosť meniť veľkosť pórov v pomerne širokom rozsahu, zavádzajúc rôzne funkčné skupiny.
Metódy viazania
V súčasnosti existujú dve zásadne odlišné možnosti imobilizácie. Prvým je získanie zlúčenín bez kovalentných väzieb s nosičom. Táto metóda je fyzická. Ďalšia možnosť zahŕňa vznik kovalentnej väzby s materiálom. Toto je chemická metóda.
Adsorpcia
Pomocou neho sa získajú imobilizované enzýmy držaním liečiva na povrchu nosiča v dôsledkudisperzné, hydrofóbne, elektrostatické interakcie a vodíkové väzby. Adsorpcia bola prvým spôsobom, ako obmedziť pohyblivosť prvkov. Ani teraz však táto možnosť nestratila svoj význam. Okrem toho sa adsorpcia považuje za najbežnejšiu metódu imobilizácie v tomto odvetví.
Funkcie metódy
Vedecké publikácie popisujú viac ako 70 enzýmov získaných adsorpčnou metódou. Nosičmi boli najmä porézne sklo, rôzne íly, polysacharidy, oxidy hliníka, syntetické polyméry, titán a iné kovy. Posledne menované sú najčastejšie používané. Účinnosť adsorpcie liečiva na nosič je určená pórovitosťou materiálu a špecifickým povrchom.
Mechanizmus účinku
Adsorpcia enzýmov na nerozpustných materiáloch je jednoduchá. Dosahuje sa kontaktom vodného roztoku liečiva s nosičom. Môže prejsť statickým alebo dynamickým spôsobom. Enzýmový roztok sa zmieša s čerstvým sedimentom, napríklad hydroxidom titaničitým. Zlúčenina sa potom suší za miernych podmienok. Enzýmová aktivita počas takejto imobilizácie je zachovaná takmer na 100 %. Špecifická koncentrácia zároveň dosahuje 64 mg na gram nosiča.
Negatívne momenty
Medzi nevýhody adsorpcie patrí nízka sila pri väzbe enzýmu a nosiča. V procese zmeny reakčných podmienok možno zaznamenať stratu prvkov, kontamináciu produktov a desorpciu proteínov. Na zlepšenie silynosiče viazania sú vopred upravené. Materiály sú spracované najmä kovovými iónmi, polymérmi, hydrofóbnymi zlúčeninami a inými polyfunkčnými činidlami. V niektorých prípadoch je samotný liek upravený. Ale dosť často to vedie k zníženiu jeho aktivity.
Zahrnutie do gélu
Táto možnosť je celkom bežná vďaka svojej jedinečnosti a jednoduchosti. Táto metóda je vhodná nielen pre jednotlivé prvky, ale aj pre multienzýmové komplexy. Zapracovanie do gélu sa môže uskutočniť dvoma spôsobmi. V prvom prípade sa liečivo spojí s vodným roztokom monoméru, po ktorom sa uskutoční polymerizácia. V dôsledku toho sa objaví priestorová gélová štruktúra obsahujúca molekuly enzýmu v bunkách. V druhom prípade sa liečivo zavedie do roztoku hotového polyméru. Potom sa uvedie do gélového stavu.
Vniknutie do priesvitných štruktúr
Podstatou tohto spôsobu imobilizácie je oddelenie vodného roztoku enzýmu od substrátu. Na to sa používa polopriepustná membrána. Umožňuje prechod prvkov kofaktorov a substrátov s nízkou molekulovou hmotnosťou a zadržiava veľké molekuly enzýmov.
Mikroenkapsulácia
Existuje niekoľko možností vloženia do priesvitných štruktúr. Z nich je najväčší záujem o mikroenkapsuláciu a inkorporáciu proteínov do lipozómov. Prvú možnosť navrhol v roku 1964 T. Chang. Spočíva v tom, že sa roztok enzýmu zavedie do uzavretej kapsuly, ktorej steny sú vyrobené z polopriepustnejpolymér. Vzhľad membrány na povrchu je spôsobený reakciou medzifázovej polykondenzácie zlúčenín. Jeden z nich je rozpustený v organickej a druhý - vo vodnej fáze. Príkladom je vytvorenie mikrokapsuly získanej polykondenzáciou halogenidu kyseliny sebakovej (organická fáza) a hexametyléndiamínu-1,6 (v tomto poradí vodná fáza). Hrúbka membrány sa počíta v stotinách mikrometra. Veľkosť kapsúl je stovky alebo desiatky mikrometrov.
Inkorporácia do lipozómov
Táto metóda imobilizácie je blízka mikroenkapsulácii. Lipozómy sú prítomné v lamelárnych alebo sférických systémoch lipidových dvojvrstiev. Táto metóda bola prvýkrát použitá v roku 1970. Na izoláciu lipozómov z lipidového roztoku sa organické rozpúšťadlo odparí. Zvyšný tenký film sa disperguje vo vodnom roztoku, v ktorom je prítomný enzým. Počas tohto procesu dochádza k samozostaveniu lipidových dvojvrstvových štruktúr. Takéto imobilizované enzýmy sú v medicíne veľmi populárne. Je to spôsobené tým, že väčšina molekúl je lokalizovaná v lipidovej matrici biologických membrán. Imobilizované enzýmy obsiahnuté v lipozómoch sú najdôležitejším výskumným materiálom v medicíne, ktorý umožňuje študovať a opísať vzorce životne dôležitých procesov.
Vytvorenie nových dlhopisov
Imobilizácia vytvorením nových kovalentných reťazcov medzi enzýmami a nosičmi sa považuje za najrozšírenejší spôsob získavania priemyselných biokatalyzátorov.destinácia. Na rozdiel od fyzikálnych metód poskytuje táto možnosť ireverzibilnú a silnú väzbu medzi molekulou a materiálom. Jeho tvorba je často sprevádzaná stabilizáciou liečiva. Súčasne umiestnenie enzýmu vo vzdialenosti 1. kovalentnej väzby vzhľadom na nosič vytvára určité ťažkosti pri realizácii katalytického procesu. Molekula je oddelená od materiálu pomocou vložky. Často sa používa ako poly- a bifunkčné činidlo. Ide najmä o hydrazín, brómkyán, dihedrid glutarovej kyseliny, sulfurylchlorid atď. Napríklad na odstránenie galaktozyltransferázy sa medzi nosič a enzým vloží nasledujúca sekvencia -CH2- NH-(CH 2)5-CO-. V takejto situácii sú v štruktúre prítomné inzert, molekula a nosič. Všetky sú spojené kovalentnými väzbami. Zásadný význam má potreba zaviesť do reakcie funkčné skupiny, ktoré nie sú nevyhnutné pre katalytickú funkciu prvku. Glykoproteíny sa teda spravidla nepripájajú k nosiču cez proteín, ale cez sacharidovú časť. Výsledkom je získanie stabilnejších a aktívnejších imobilizovaných enzýmov.
Cells
Vyššie opísané metódy sa považujú za univerzálne pre všetky typy biokatalyzátorov. Patria sem okrem iného bunky, subcelulárne štruktúry, ktorých imobilizácia je v poslednom čase rozšírená. Dôvodom je nasledovné. Keď sú bunky imobilizované, nie je potrebné izolovať a čistiť enzýmové prípravky alebo zavádzať kofaktory do reakcií. V dôsledku toho je to možnésystémy, ktoré vykonávajú viacstupňové nepretržité procesy.
Použitie imobilizovaných enzýmov
Vo veterinárnej medicíne, priemysle a iných hospodárskych odvetviach sú lieky získané vyššie uvedenými metódami veľmi populárne. Prístupy vyvinuté v praxi poskytujú riešenie problémov cieleného dodávania liečiv do organizmu. Imobilizované enzýmy umožnili získať lieky s predĺženým účinkom s minimálnou alergénnosťou a toxicitou. V súčasnosti vedci riešia problémy spojené s biokonverziou hmoty a energie pomocou mikrobiologických prístupov. Medzitým výrazne prispieva k práci aj technológia imobilizovaných enzýmov. Vyhliadky na rozvoj sa zdajú byť dosť široké. Jednou z kľúčových úloh v procese monitorovania stavu životného prostredia by teda v budúcnosti mali byť nové typy analýz. Hovoríme najmä o bioluminiscenčných a enzýmových imunoanalytických metódach. Pokročilé prístupy sú obzvlášť dôležité pri spracovaní lignocelulózových surovín. Imobilizované enzýmy sa môžu použiť ako zosilňovače slabého signálu. Aktívne centrum môže byť pod vplyvom nosiča, ktorý je pod ultrazvukom, mechanickým namáhaním alebo podlieha fytochemickým premenám.
