Čo je základom hybridizácie DNA? Hoci je sekvencia dvojvláknovej DNA vo fyziologických podmienkach vo všeobecnosti stabilná, zmena týchto podmienok v laboratóriu (zvyčajne zvýšením teploty okolia) spôsobí, že sa molekuly rozdelia na jednotlivé vlákna. Posledne menované sú navzájom komplementárne, ale môžu tiež dopĺňať iné sekvencie prítomné v ich prostredí. Zníženie okolitej teploty umožňuje jednovláknovým molekulám žíhať alebo "hybridizovať" navzájom. Toto je metóda hybridizácie DNA.
Koncept z pohľadu molekulárnej biológie
Vedci zapojení do replikácie DNA a transkripcie DNA do RNA sa spoliehajú na kríženie nukleotidov a techniky molekulárnej biológie. To zahŕňa Southern a Northern bloty, polymerázovú reťazovú reakciu (PCR) a väčšinu prístupov hybridizácie a sekvenovania DNA-RNA.
Aplikácia
Hybridizácia je hlavnou vlastnosťou nukleotidusekvencií a používa sa v mnohých metódach molekulárnej biológie. Celkový genetický vzťah dvoch druhov možno určiť hybridizáciou segmentov ich DNA (hybridizácia DNA-DNA). Kvôli podobnosti sekvencií medzi blízko príbuznými organizmami je na roztavenie takýchto hybridov DNA potrebná vyššia teplota v porovnaní so vzdialenejšími organizmami. Rôzne metódy využívajú hybridizáciu na určenie pôvodu vzorky DNA, vrátane polymerázovej reťazovej reakcie (PCR). V inom spôsobe sa krátke sekvencie DNA hybridizujú s bunkovou mRNA, aby sa identifikovali exprimované gény. Farmaceutické spoločnosti skúmajú použitie antisense RNA na naviazanie sa na nežiaducu mRNA, čím bránia ribozómu prekladať mRNA na proteín.
DNA-DNA hybridizácia vo všeobecnosti označuje techniku molekulárnej biológie, ktorá meria stupeň genetickej podobnosti medzi súbormi DNA sekvencií. Bežne sa používa na určenie genetickej vzdialenosti medzi dvoma organizmami. Je široko používaný vo fylogenéze a taxonómii.
Metodológia
DNA z jedného organizmu bola označená a potom zmiešaná s neoznačenou DNA, ktorá sa s ňou dala porovnať. Zmes sa inkubuje, aby sa vlákna DNA disociovali, a potom sa ochladí, aby sa vytvorila regenerovaná hybridná dvojvláknová DNA. Hybridizované sekvencie s vysokým stupňom podobnosti sa budú viazať pevnejšie a vyžadujú viac energie na ich oddelenie: t. j. oddelia sa pri zahrievaní na vyššiuteplotu než rozdielne sekvencie, proces známy ako "topenie DNA".
Topenie DNA
Pri vyhodnotení profilu topenia hybridizovanej DNA sa dvojvláknová DNA naviaže na takzvaný "stĺpec" a výsledná zmes sa zahreje. V každom kroku sa kolóna premyje a sekvencie DNA, ktoré sa topia, sa stanú jednovláknovými a vymyjú sa z kolóny. Teploty, pri ktorých značená DNA opúšťa kolónu, odráža mieru podobnosti medzi sekvenciami (a vzor samoskladania slúži ako kontrola). Tieto výsledky sa kombinujú, aby sa určil stupeň genetickej podobnosti medzi organizmami. Podľa modernej mikrobiológie je hybridizácia DNA nemožná bez pochopenia týchto vecí.
Keď sa týmto spôsobom porovnávajú viaceré druhy ribonukleovej kyseliny (alebo deoxyribonukleovej kyseliny), hodnoty podobnosti umožňujú zaradenie druhu do fylogenetického stromu. Preto je to jeden z možných prístupov k vedeniu molekulárnej systematiky. Charles Sibley a John Ahlquist, priekopníci tejto techniky, použili hybridizáciu DNA-DNA na štúdium fylogenetických vzťahov vtákov (taxonómia Sibley-Ahlquist) a primátov.
Dôležitosť pre biológiu
Hybridizácia DNA-DNA je zlatým štandardom na rozlíšenie bakteriálnych druhov s hodnotou podobnosti viac ako 70 %, čo naznačuje, že porovnávané kmene patria k rôznym druhom. V roku 2014 bola na oddelenie bakteriálneho poddruhu navrhnutá hranica podobnosti 79 %.
Kritici tvrdia, že táto technika je nepresná na porovnávanie blízko príbuzných druhov, pretože akýkoľvek pokus o meranie rozdielov medzi ortologickými sekvenciami medzi organizmami je premožený hybridizáciou paralógnych náprotivkov v genóme organizmu. Sekvenovanie DNA a porovnávanie výpočtových sekvencií sú v súčasnosti bežne používanou metódou na určenie genetickej vzdialenosti, hoci tento prístup sa stále používa v mikrobiológii na pomoc pri identifikácii baktérií.
Súčasný spôsob je uskutočniť hybridizáciu DNA-DNA v silikóne s použitím úplne alebo čiastočne sekvenovaných genómov. GGDC vyvinutý DSMZ je najpresnejší známy nástroj na výpočet hodnôt podobných DDH. Okrem iných algoritmických vylepšení rieši problém s paralogickými sekvenciami ich starostlivým odfiltrovaním zo zhôd medzi dvoma sekvenciami genómu.
FISH metóda
Fluorescenčná in situ hybridizácia (FISH) je laboratórna technika používaná na detekciu a sekvenovanie DNA, často na špecifickom chromozóme.
V roku 1969 publikovali Joseph Gall a Mary Lou Pardu dokument, ktorý demonštroval, že rádioaktívne kópie sekvencie ribozomálnej DNA možno použiť na detekciu komplementárnych sekvencií DNA v jadre žabieho vajíčka. Od týchto pôvodných pozorovaní mnohé vylepšenia zvýšili všestrannosť acitlivosť postupu do takej miery, že hybridizácia in situ („na mieste“, latinsky) sa dnes považuje za dôležitý nástroj v cytogenetike. (Termín in situ sa teraz používa aj na označenie počiatočného štádia rastu karcinómu, keď sa na patologickom procese podieľa iba epiteliálne tkanivo.)
Fluorescenčná hybridizačná sekvencia
Sondy RNA môžu byť navrhnuté pre akýkoľvek gén alebo akúkoľvek sekvenciu v géne na vizualizáciu lncRNA a miRNA mRNA v tkanivách a bunkách. FISH sa používa na štúdium cyklu reprodukcie buniek, najmä jadrovej interfázy na akékoľvek chromozomálne abnormality. FISH vám umožňuje analyzovať veľkú sériu archívnych prípadov, je oveľa jednoduchšie identifikovať identifikovaný chromozóm vytvorením sondy s umelou chromozómovou bázou, ktorá pritiahne podobné chromozómy.
Hybridizačné signály pre každú sondu, keď sa deteguje jadrová abnormalita: každá detekčná sonda mRNA a lncRNA pozostáva z 20 párov oligonukleotidov, pričom každý pár pokrýva priestor 40-50 bp. p. Sondy používajú na detekciu mRNA patentovanú chémiu.
Hybridizácia s DNA sondami
Sondy sa často vyrábajú z fragmentov DNA, ktoré boli izolované, purifikované a amplifikované na použitie pri navrhovaní ľudského genómu. Veľkosť ľudského genómu je taká veľká v porovnaní s dĺžkou, ktorú možno priamo sekvenovať, že je potrebné rozdeliť ho naúlomky. Nakoniec boli tieto fragmenty usporiadané natrávením kópie každého fragmentu na ešte menšie jednotky pomocou sekvenčne špecifických endonukleáz na meranie veľkosti každého malého fragmentu pomocou vylučovacej chromatografie s použitím týchto informácií na určenie, kde sa veľké fragmenty navzájom prekrývajú..
Na zachovanie prvkov s ich individuálnymi sekvenciami DNA boli fragmenty pridané do systému neustále sa opakujúcich bakteriálnych populácií. Klonálne populácie baktérií, z ktorých každá si udržiava jeden umelý chromozóm, sú uložené v rôznych laboratóriách po celom svete. Umelé chromozómy (BAC) možno pestovať, extrahovať a označovať v akomkoľvek laboratóriu, ktoré obsahuje knižnicu. Genomické knižnice sú často pomenované podľa inštitúcií, kde boli vyvinuté. Príkladom je knižnica RPCI-11, pomenovaná podľa Roswell Cancer Institute v Buffale (New York, USA). Tieto fragmenty tvoria asi 100 tisíc párov báz a sú základom väčšiny sond FISH.
