Metóda tkanivových kultúr je jedným z hlavných nástrojov modernej biotechnológie, ktorý umožňuje riešiť praktické problémy rastlinnej fyziológie, biochémie a genetiky. Umelé pestovanie materiálu sa vykonáva za určitých podmienok: sterilizácia, kontrola teploty a vystavenie špeciálnemu živnému médiu.
Essence
Metódou tkanivových kultúr je ich dlhodobé uchovávanie a/alebo umelá kultivácia v laboratórnych podmienkach na živnom médiu. Táto technológia vám umožňuje vytvoriť biologický model na štúdium rôznych procesov v bunkách, ktoré existujú mimo tela rastlín, ľudí a zvierat.
Reprodukcia rastlinnej tkanivovej kultúry je založená na vlastnosti totipotencie - schopnosti buniek vyvinúť sa do celého organizmu. U zvierat sa to realizuje iba v oplodnených vajíčkach (s výnimkou niektorých typov koelenterátov).
História vývoja
Prvé pokusy o kultiváciu rastlinných tkanív uskutočnili nemeckí vedci na prelome 19.-20. Napriek tomu, že boli neúspešné, vzniklo množstvo nápadov, ktoré sa neskôr potvrdili.
V roku 1922 dokázali W. Robbins a W. Kotte nezávisle od seba vypestovať špičky koreňov kukurice a paradajky na umelom živnom médiu. Podrobné štúdium techník bunkových a tkanivových kultúr sa začalo v tridsiatych rokoch minulého storočia. 20. storočie R. Gautre a F. White dokázali, že pri pravidelnej transplantácii tkanivových kultúr do čerstvého živného média môžu rásť donekonečna.
Do roku 1959 sa v laboratórnych podmienkach pestovalo 142 druhov rastlín. V druhej polovici XX storočia. začalo sa aj používanie rozptýlených (oddelených) buniek.
Typy testovacieho materiálu
Existujú 2 hlavné typy rastlinných tkanivových kultúr:
- Vyrobené bez deštrukcie a so zachovaním charakteristických vlastností, ktoré sú vlastné živému organizmu.
- Extrahuje sa degradáciou (chemickou, enzymatickou alebo mechanickou) z primárneho tkaniva. Môže byť vytvorený z jednej alebo viacerých bunkových kultúr.
Podľa spôsobu pestovania sa rozlišujú tieto metódy:
- na „výživnej vrstve“, v ktorej sa látka, ktorá stimuluje rast tkaniva, vylučuje delením buniek rovnakého rastlinného druhu;
- použitie tkaniva sestry vedľa kultivovaných buniek;
- použitie živného média z izolovanej deliacej sa bunkovej skupiny;
- rast jednotlivých jednotlivých buniek v mikrokvapkách nasýtených zložením.
Kultivácia z jednotlivých buniek je spojená s určitými ťažkosťami. Aby sme ich umelo „donútili“rozdeliť sa, musia dostať signál zo susedných, aktívne fungujúcich buniek.
Jedným z hlavných typov tkaniva pre fyziologický výskum je kalus, ktorý vzniká pri nepriaznivých vonkajších faktoroch (zvyčajne mechanické poškodenie). Majú schopnosť stratiť špecifické vlastnosti pôvodného tkaniva. V dôsledku toho sa bunky kalusu začnú aktívne deliť a tvoria sa časti rastliny.
Potrebné podmienky
Úspech metódy kultivácie tkanív a buniek závisí od nasledujúcich faktorov:
- Súlad so sterilitou. Na transplantáciu sa používajú špeciálne boxy s dodávaným čisteným vzduchom, vybavené ultrafialovými lampami. Nástroje a materiály, odev a ruky personálu by mali byť podrobené aseptickému spracovaniu.
- Používanie špeciálne vybraných živných médií obsahujúcich zdroje uhlíka a energie (zvyčajne sacharóza a glukóza), mikro- a makroživiny, rastové regulátory (auxíny, cytokiníny), vitamíny (tiamín, riboflavín, kyselina askorbová a pantoténová a iné).
- Súlad s teplotou (18-30 °C), svetelnými podmienkami a vlhkosťou (60-70%). Väčšina kalusových tkanivových kultúr sa pestuje pri okolitom svetle, pretože neobsahujú chloroplasty, ale niektoré rastliny vyžadujú podsvietenie.
Momentálne pripravenékomerčné zostavy (Murasige a Skoog, Gamborg a Eveleg, White, Kao a Mikhailyuk a ďalší).
Pre a proti
Výhody metódy bunkovej a tkanivovej kultúry sú:
- dobrá reprodukovateľnosť získaných výsledkov;
- regulácia medzibunkových interakcií;
- nízka spotreba činidiel;
- genetická homogenita bunkových línií;
- možnosť mechanizácie procesu pestovania;
- kontrola podmienok v klietke;
- skladovanie živých kultúr pri nízkej teplote.
Nevýhoda tejto biotechnológie je:
- musíte dodržiavať prísne podmienky aseptiky;
- nestabilita vlastností buniek a možnosť ich nežiaduceho miešania;
- vysoké náklady na chemikálie;
- neúplná ekvivalencia kultivovaných tkanív a buniek v živom organizme.
Aplikácia
Metóda tkanivovej kultúry použitá na výskum:
- procesy vo vnútri buniek (syntéza DNA, RNA a bielkovín, metabolizmus a jeho ovplyvnenie pomocou liekov);
- medzibunkové reakcie (prechod látok cez bunkové membrány, práca komplexu hormón-receptor, schopnosť buniek k sebe navzájom priľnúť, tvorba histologických štruktúr);
- interakcie s prostredím (absorpcia živín, prenos infekcií, procesy vzniku a vývojanádory a iné);
- výsledky genetických manipulácií s bunkami.
Sľubné oblasti biológie a farmakológie, pri vývoji ktorých sa táto technológia využíva, sú:
- získavanie účinných herbicídov, rastových regulátorov pre agronomické plodiny, biologicky aktívnych zlúčenín na použitie pri výrobe liečiv (alkaloidy, steroidy a iné);
- riadená mutagenéza, šľachtenie nových hybridov, prekonanie postgamickej nekompatibility;
- klonálne rozmnožovanie, ktoré vám umožňuje získať veľké množstvo geneticky identických rastlín;
- šľachtenie rastlín odolných voči vírusom a bez vírusov;
- kryoprezervácia genofondu;
- rekonštrukcia tkaniva, vytváranie zdrojov kmeňových buniek (tkanivové inžinierstvo).
