Pri štúdiu látok v organickej chémii sa na stanovenie obsahu určitých zlúčenín používa viac ako tucet rôznych kvalitatívnych reakcií. Takáto vizuálna analýza vám umožní okamžite pochopiť, či sú prítomné potrebné látky, a ak nie sú prítomné, môžete výrazne obmedziť ďalšie experimenty na ich identifikáciu. Tieto reakcie zahŕňajú ninhydrín, ktorý je hlavnou reakciou pri vizuálnom stanovení aminozlúčenín.
Čo je toto?
Ninhydrín je dikarbonylová zlúčenina obsahujúca jeden aromatický kruh s pripojeným heterocyklom, ktorého druhý atóm má 2 hydroxylové skupiny (OH-). Táto látka sa získava priamou oxidáciou inandiónu - 1, 3, a preto má podľa medzinárodnej nomenklatúry tento názov: 2, 2 - dihydroxyinandión -1, 3 (obr. 1).
Čistý ninhydrín je žltý alebo biely kryštálfarby, ktoré sa po zahriatí dobre rozpúšťajú vo vode a iných polárnych organických rozpúšťadlách, ako je acetón. Ide o pomerne škodlivú látku, ak sa dostane do kontaktu s pokožkou vo veľkom množstve alebo so sliznicami, spôsobuje podráždenie, a to aj pri vdýchnutí. S touto zlúčeninou by ste mali pracovať opatrne a iba v rukaviciach, pretože pri kontakte s pokožkou reaguje s proteínmi kožných buniek a farbí ju do fialova.
Reaktívne látky
Ako je uvedené vyššie, ninhydrínová reakcia sa používa predovšetkým na vizuálne stanovenie obsahu aminozlúčenín:
- α-aminokyseliny (vrátane bielkovín);
- aminocukry;
- alkaloidy obsahujúce –NH2 a -NH skupiny;
- rôzne amíny.
Treba poznamenať, že sekundárne a terciárne amíny niekedy reagujú veľmi slabo, takže na potvrdenie ich prítomnosti je potrebný ďalší výskum.
Na kvantitatívne stanovenie sa používajú rôzne metódy chromatografie, napríklad papierová chromatografia (BC), chromatografia na tenkej vrstve (TLC) alebo s premývaním pevných nosičov roztokom ninhydrínu v rôznych médiách.
Táto reakcia nie je špecifická pre aminozlúčeniny, pretože do nej môže vstúpiť činidlo naraz. Na strane reakčných produktov má však zvláštnosť v podobe uvoľňovania bublín oxidu uhličitého (CO2), čo je typické iba pri interakcii s α-aminoskupinou. kyseliny.
Funkcie mechanizmu
BV literatúre existujú rôzne interpretácie rovnice ninhydrínovej reakcie. Niektorí bádatelia vynechávajú tvorbu hydrindantínu z 2-aminoinandiónu, ktorý za účasti amoniaku a ninhydrínu tvorí aj farbivo nazývané „Ruemanova fialová“(alebo „Ruemanova modrá“), iní naopak predpokladajú len jej účasť bez prítomnosti medziproduktov aminoproduktov. V zázname samotnej reakcie je tiež niekoľko zaujímavých bodov, najmä sa to týka spôsobov pripojenia aminoderivátu ninhydrínu k jeho hlavnej molekule za vzniku farbiva. Otázne zostáva aj označenie miesta „chodiaceho vodíka“získaného intermediárnym amínom z vodného média: môže byť buď v ketónovej skupine alebo vedľa –NH2.
V skutočnosti je nuansa s atómom H bezvýznamná, pretože jeho poloha v zlúčenine nehrá zvláštnu úlohu v priebehu reakcie, takže by sa jej nemala venovať pozornosť. Pokiaľ ide o vynechanie jednej z možných etáp, dôvod tu spočíva v teoretickom aspekte: doteraz nebol presne stanovený presný mechanizmus vzniku Ruemanovho purpuru, takže možno nájsť celkom odlišné schémy ninhydrínovej reakcie.
Najúplnejší možný priebeh interakcie činidla s aminozlúčeninami bude navrhnutý nižšie.
Reakčný mechanizmus
Po prvé, ninhydrín interaguje s α-aminokyselinou, pripája ju v mieste štiepenia hydroxyskupín a vytvára kondenzačný produkt (obr. 2a). Potom sa deštruuje, pričom sa uvoľní medziprodukt amín, aldehyd a oxid uhličitý (obr. 2b). Z finálneho produktu pri spájaníninhydrínom sa syntetizuje Ruemanova purpurová štruktúra (diketonhydrindenketohydrínamín, obr. 2c). Naznačená je aj možná tvorba hydrindantínu (redukovaného ninhydrínu) z medziproduktu amínu, ktorý sa tiež v prítomnosti amoniaku (presnejšie hydroxidu amónneho) s nadbytkom samotného činidla (obr. 2d) mení na farbivo (obr. 2d).
Tvorbu hydrindantínu dokázal samotný Rueman, keď sírovodík pôsobí na molekulu ninhydrínu. Táto zlúčenina sa môže rozpustiť v uhličitane sodnom Na2CO3, čím sa roztok zafarbí na tmavočerveno. A keď sa pridá zriedená kyselina chlorovodíková, vyzráža sa hydrindantín.
S najväčšou pravdepodobnosťou sú medziprodukt amín, hydridantín, ninhydrín a štruktúra farbiva v dôsledku ich nestability pri zahrievaní v určitej rovnováhe, čo umožňuje prítomnosť niekoľkých ďalších stupňov.
Tento mechanizmus je vhodný na vysvetlenie ninhydrínovej reakcie s inými aminozlúčeninami, s výnimkou vedľajších produktov vznikajúcich pri eliminácii zvyšku štruktúry z –NH2, -NH alebo -N.
Biuretový test a iné reakcie na bielkoviny
Kvalitatívna analýza peptidových väzieb dokonca aj neproteínových štruktúr môže prebiehať nielen za účasti vyššie uvedeného činidla. V prípade ninhydrínovej reakcie na proteíny však interakcia neprebieha pozdĺž –CO-NH‒ skupín, ale pozdĺž amínových skupín. Existuje takzvaná "biuretová reakcia", ktorá sa vyznačuje pridaním iónov do roztoku s aminozlúčeninamidvojmocná meď z CuSO4 alebo Cu(OH)2 v alkalickom prostredí (obr. 3).
Počas analýzy, v prítomnosti potrebných štruktúr, sa roztok sfarbí do tmavomodra v dôsledku väzby peptidových väzieb na farebný komplex, ktorý odlišuje jedno činidlo od druhého. Preto sú biuretové a ninhydrínové reakcie univerzálne vo vzťahu k proteínovým a neproteínovým štruktúram so skupinou –CO-NH‒.
Pri stanovení cyklických aminokyselín sa používa xantoproteínová reakcia s koncentrovaným roztokom kyseliny dusičnej HNO3 , ktorá pri nitrácii dáva žltú farbu. Kvapka činidla na koži tiež vykazuje žltú farbu reakciou s aminokyselinami v kožných bunkách. Kyselina dusičná môže spôsobiť popáleniny a tiež by sa s ňou malo manipulovať v rukaviciach.
Príklady interakcie s aminozlúčeninami
Ninhydrínová reakcia pre α-aminokyseliny poskytuje dobrý vizuálny výsledok, s výnimkou farebných prolínových a hydroxyprolínových štruktúr, ktoré reagujú za vzniku žltej farby. Možné vysvetlenie tohto efektu sa našlo v iných podmienkach prostredia interakcie ninhydrínu s týmito štruktúrami.
Reakcia s aminoskupinou
Keďže test nie je špecifický, vizuálna detekcia alanínu pomocou ninhydrínovej reakcie v zmesi nie je možná. Avšak papierovou chromatografiou, pri aplikácii vzoriek rôznych α-aminokyselín, ich postriekaní vodným roztokom ninhydrínu a vyvolaní v špeciálnom médiu, je možnévypočítajte kvantitatívne zloženie nielen nárokovanej zlúčeniny, ale aj mnohých ďalších.
Schematicky, interakcia alanínu s ninhydrínom sa riadi rovnakým princípom. Naviaže sa na činidlo na amínovej skupine a pôsobením aktívnych hydróniových iónov (H3O+) sa odštiepi na uhlíku. -dusíková väzba, rozkladá sa na acetaldehyd (CH3COH) a oxid uhličitý (CO2). Ďalšia molekula ninhydrínu sa naviaže na dusík, čím sa vytesnia molekuly vody a vytvorí sa farebná štruktúra (obr. 4).
Reakcia s heterocyklickou aminozlúčeninou
Reakcia ninhydrínu s prolínom je špecifická najmä pri chromatografických analýzach, pretože takéto štruktúry v kyslom prostredí najskôr zožltnú a potom v neutrálnom zfialovia. Výskumníci to vysvetľujú rysom preskupenia cyklu v medziprodukte, ktorý je ovplyvnený práve prítomnosťou veľkého počtu vodíkových protónov, ktoré dopĺňajú vonkajšiu energetickú hladinu dusíka.
Deštrukcia heterocyklu nenastane a na 4. atóme uhlíka je k nemu pripojená ďalšia molekula ninhydrínu. Po ďalšom zahrievaní sa výsledná štruktúra v neutrálnom médiu zmení na Ruemanovu fialovú (obr. 5).
Príprava hlavného činidla
Ninhydrínový test sa vykonáva s rôznymi roztokmi v závislosti od rozpustenia aminoštruktúr v určitých organických aanorganické zlúčeniny.
Hlavným činidlom je príprava 0,2% roztoku vo vode. Ide o všestrannú zmes, pretože väčšina zlúčenín sa dobre rozpúšťa v H2O. Na získanie čerstvo pripraveného činidla sa vzorka 0,2 g chemicky čistého ninhydrínu zriedi v 100 ml vody.
Za zmienku stojí, že pre niektoré analyzované roztoky je táto koncentrácia nedostatočná, takže je možné pripraviť 1% alebo 2% roztoky. To je typické pre extrakty z liečivých surovín, pretože obsahujú rôzne triedy aminozlúčenín.
Pri vykonávaní chromatografických štúdií môžu byť roztoky, napríklad pri premývaní zmesi na pevnom nosiči cez kolónu, pripravené v alkohole, dimetylsulfoxide, acetóne a iných polárnych rozpúšťadlách - všetko bude závisieť od rozpúšťadla určitých amino štruktúry.
Aplikácia
Ninhydrínová reakcia umožňuje detegovať veľa aminozlúčenín v roztoku, čím sa stala jednou z prvých, ktoré boli použité pri kvalitatívnej analýze organických látok. Vizuálne určovanie výrazne znižuje počet experimentov, najmä pri analýze zle preštudovaných rastlín, liečiv a liekových foriem, ako aj neznámych roztokov a zmesí.
Vo forenznej vede je táto metóda široko používaná na určenie prítomnosti potných stôp na akomkoľvek povrchu.
Aj napriek nešpecifickosti reakcie je stiahnutie ninhydrínovej reakcie z chemickej praxe nemožné, pretoženahradenie tejto látky menej toxickými analógmi (napríklad oxolin) dokázalo, že majú horšiu citlivosť na aminoskupiny a nedávajú dobré výsledky vo fotometrických analýzach.
