Proteín je základnou zložkou všetkých organizmov. Každá z jeho molekúl pozostáva z jedného alebo viacerých polypeptidových reťazcov pozostávajúcich z aminokyselín. Hoci sú informácie potrebné pre život zakódované v DNA alebo RNA, rekombinantné proteíny vykonávajú v organizmoch široké spektrum biologických funkcií, vrátane enzymatickej katalýzy, ochrany, podpory, pohybu a regulácie. Podľa ich funkcií v organizme možno tieto látky rozdeliť do rôznych kategórií, ako sú protilátky, enzýmy, štruktúrna zložka. Vzhľadom na ich dôležité funkcie boli takéto zlúčeniny intenzívne študované a široko používané.
V minulosti bolo hlavným spôsobom, ako získať rekombinantný proteín, jeho izolácia z prírodného zdroja, čo je zvyčajne neefektívne a časovo náročné. Nedávne pokroky v biologickej molekulárnej technológii umožnili klonovať DNA kódujúcu špecifický súbor látok do expresného vektora pre látky, ako sú baktérie, kvasinky, hmyzie bunky a bunky cicavcov.
Jednoducho povedané, rekombinantné proteíny sa prekladajú prostredníctvom produktov exogénnej DNA doživé bunky. Ich získanie zvyčajne zahŕňa dva hlavné kroky:
- Klonovanie molekuly.
- Vyjadrenie bielkovín.
V súčasnosti je výroba takejto štruktúry jednou z najsilnejších metód používaných v medicíne a biológii. Zloženie má široké uplatnenie vo výskume a biotechnológiách.
Lekársky smer
Rekombinantné proteíny poskytujú dôležitú liečbu rôznych chorôb, ako je cukrovka, rakovina, infekčné choroby, hemofília a anémia. Typické formulácie takýchto látok zahŕňajú protilátky, hormóny, interleukíny, enzýmy a antikoagulanty. Existuje rastúca potreba rekombinantných formulácií na terapeutické použitie. Umožňujú vám rozšíriť metódy liečby.
geneticky upravené rekombinantné proteíny hrajú kľúčovú úlohu na trhu s terapeutickými liekmi. Cicavčie bunky v súčasnosti produkujú najviac terapeutických činidiel, pretože ich formulácie sú schopné produkovať vysoko kvalitné látky podobné prírodným. Okrem toho sa v E. coli produkuje mnoho schválených rekombinantných terapeutických proteínov vďaka dobrej genetike, rýchlemu rastu a vysokej produktivite. Má tiež pozitívny vplyv na vývoj liekov na báze tejto látky.
Výskum
Získanie rekombinantných proteínov je založené na rôznych metódach. Látky pomáhajú zistiť základné a základné princípy tela. Tieto molekuly možno použiť na identifikáciu a určenieumiestnenie látky kódovanej konkrétnym génom a odhaliť funkciu iných génov v rôznych bunkových aktivitách, ako je bunková signalizácia, metabolizmus, rast, replikácia a smrť, transkripcia, translácia a modifikácia zlúčenín diskutovaných v tomto článku.
Pozorované zloženie sa teda často používa v molekulárnej biológii, bunkovej biológii, biochémii, štrukturálnych a biofyzikálnych štúdiách a mnohých ďalších oblastiach vedy. Zároveň je získavanie rekombinantných proteínov medzinárodnou praxou.
Takéto zlúčeniny sú užitočnými nástrojmi na pochopenie medzibunkových interakcií. Osvedčili sa pri niekoľkých laboratórnych metódach, ako je ELISA a imunohistochémia (IHC). Rekombinantné proteíny sa môžu použiť na vývoj enzýmových testov. Pri použití v kombinácii s párom vhodných protilátok možno bunky použiť ako štandardy pre nové technológie.
Biotechnológia
Rekombinantné proteíny obsahujúce sekvenciu aminokyselín sa používajú aj v priemysle, výrobe potravín, poľnohospodárstve a bioinžinierstve. Napríklad pri chove zvierat možno do potravín pridávať enzýmy na zvýšenie nutričnej hodnoty zložiek krmiva, zníženie nákladov a odpadu, podporu zdravia čriev zvierat, zlepšenie produktivity a zlepšenie životného prostredia.
Okrem toho dlhodobo baktérie mliečneho kvasenia (LAB).sa používajú na výrobu fermentovaných potravín a nedávno bol vyvinutý LAB na expresiu rekombinantných proteínov obsahujúcich aminokyselinovú sekvenciu, ktoré možno široko použiť napríklad na zlepšenie trávenia u ľudí, zvierat a výživy.
Tieto látky však majú tiež obmedzenia:
- V niektorých prípadoch je produkcia rekombinantných proteínov zložitá, nákladná a časovo náročná.
- Látky produkované v bunkách sa nemusia zhodovať s prírodnými formami. Tento rozdiel môže znížiť účinnosť terapeutických rekombinantných proteínov a dokonca spôsobiť vedľajšie účinky. Okrem toho môže tento rozdiel ovplyvniť výsledky experimentov.
- Hlavným problémom všetkých rekombinantných liekov je imunogenicita. Všetky biotechnologické produkty môžu vykazovať určitú formu imunogenicity. Je ťažké predpovedať bezpečnosť nových terapeutických proteínov.
Pokrok v biotechnológii vo všeobecnosti zvýšil a uľahčil produkciu rekombinantných proteínov pre rôzne aplikácie. Hoci stále majú určité nevýhody, látky sú dôležité v medicíne, výskume a biotechnológiách.
Odkaz na chorobu
rekombinantný proteín nie je pre ľudí škodlivý. Je len integrálnou súčasťou celkovej molekuly pri vývoji konkrétneho liečiva alebo výživového prvku. Mnohé lekárske štúdie ukázali, že nútená expresia proteínu FGFBP3 (skrátene BP3) v laboratórnom kmeni obéznych myší preukázala významné zníženie ich telesného tuku.hmotnosť, napriek genetickej predispozícii na užívanie.
Výsledky týchto štúdií ukazujú, že proteín FGFBP3 môže ponúknuť novú terapiu porúch spojených s metabolickým syndrómom, ako je diabetes 2. typu a stukovatenie pečene. Ale pretože BP3 je prírodný proteín a nie umelý liek, klinické skúšky rekombinantného ľudského BP3 by sa mohli začať po poslednom kole predklinických štúdií. To znamená, že existujú dôvody súvisiace s bezpečnosťou vykonávania takýchto štúdií. Rekombinantný proteín nie je škodlivý pre ľudí vďaka jeho postupnému spracovaniu a čisteniu. Zmeny sa dejú aj na molekulárnej úrovni.
PD-L2, jeden z kľúčových hráčov v imunoterapii, bol nominovaný na Nobelovu cenu za fyziológiu a medicínu za rok 2018. Táto práca, ktorú začali Prof. James P. Allison z USA a Prof. Tasuku Honjo z Japonska, viedla k liečbe rakoviny, ako je melanóm, rakovina pľúc a iné, na základe kontrolnej imunoterapie. Nedávno AMSBIO pridalo do svojej imunoterapeutickej línie nový významný produkt, aktivátor PD-L2/TCR - CHO Recombinant Cell Line.
V experimentoch zameraných na overenie koncepcie výskumníci z University of Alabama v Birminghame pod vedením H. Long Zheng, MD, profesora Roberta B. Adamsa a riaditeľa laboratórnej medicíny, Katedra patológie, UAB School of Medicína zdôraznila potenciálnu terapiu zriedkavej, ale smrteľnej poruchy krvácania, TTP.
Výsledky tohtoštúdie po prvýkrát demonštrujú, že transfúzia krvných doštičiek naplnených rADAMTS13 môže byť novým a potenciálne účinným terapeutickým prístupom pre arteriálnu trombózu spojenú s vrodeným a imunitne sprostredkovaným TTP.
Rekombinantný proteín nie je len živinou, ale aj liečivom v zložení vyvíjaného liečiva. Toto je len niekoľko oblastí, ktoré sa dnes zaoberajú medicínou a súvisia so štúdiom všetkých jej štruktúrnych prvkov. Ako ukazuje medzinárodná prax, štruktúra látky umožňuje na molekulárnej úrovni riešiť mnohé vážne problémy v ľudskom tele.
Vývoj vakcín
Rekombinantný proteín je špecifický súbor molekúl, ktoré možno modelovať. Podobná vlastnosť sa využíva pri vývoji vakcín. Nová stratégia očkovania, známa aj ako použitie špeciálnej injekcie rekombinantného vírusu, by mohla ochrániť milióny kurčiat ohrozených vážnym respiračným ochorením, uviedli vedci z University of Edinburgh a Pirbright Institute. Tieto vakcíny používajú neškodné alebo slabé verzie vírusu alebo baktérie na zavedenie zárodkov do buniek tela. V tomto prípade odborníci použili rekombinantné vírusy s rôznymi spike proteínmi ako vakcíny na vytvorenie dvoch verzií neškodného vírusu. Okolo tohto spojenia je vybudovaných veľa rôznych liekov.
Obchodné názvy a analógy rekombinantných proteínov sú nasledovné:
- "Fortelizín".
- "Z altrap".
- "Eylea".
Ide najmä o protirakovinové lieky, ale s touto účinnou látkou sú spojené aj iné oblasti liečby.
Nová vakcína, nazývaná tiež LASSARAB, navrhnutá na ochranu ľudí pred horúčkou Lassa a besnotou, preukázala sľubné výsledky v predklinických štúdiách podľa novej štúdie publikovanej vo vedeckom časopise Nature Communications. Kandidát na inaktivovanú rekombinantnú vakcínu používa oslabený vírus besnoty.
Výskumný tím vložil genetický materiál vírusu Lassa do vektora vírusu besnoty, aby vakcína exprimovala povrchové proteíny v bunkách Lassa aj v bunkách besnoty. Tieto povrchové zlúčeniny vyvolávajú imunitnú odpoveď proti infekčným agens. Táto vakcína bola potom inaktivovaná, aby „zničila“živý vírus besnoty, ktorý bol použitý na výrobu nosiča.
Získanie metód
Existuje niekoľko systémov výroby látky. Všeobecný spôsob získania rekombinantného proteínu je založený na získaní biologického materiálu zo syntézy. Ale sú aj iné spôsoby.
V súčasnosti existuje päť hlavných výrazových systémov:
- Systém expresie E. coli.
- Kvasnicový expresný systém.
- Systém expresie hmyzích buniek.
- Systém expresie buniek cicavcov.
- Bezbunkový proteínový expresný systém.
Posledná možnosť je obzvlášť vhodná na expresiu transmembránových proteínova toxické zlúčeniny. V posledných rokoch sa do buniek in vitro úspešne integrovali látky, ktoré sa ťažko exprimujú konvenčnými intracelulárnymi metódami. V Bielorusku sa široko používa produkcia rekombinantných proteínov. Existuje množstvo štátnych podnikov, ktoré sa zaoberajú touto problematikou.
Cell Free Protein Synthesis System je rýchla a účinná metóda na syntézu cieľových látok pridaním rôznych substrátov a energetických zlúčenín potrebných na transkripciu a transláciu v enzymatickom systéme bunkových extraktov. V posledných rokoch sa postupne objavili výhody bezbunkových metód pre typy látok, ako sú zložité toxické membrány, čo dokazuje ich potenciálne uplatnenie v biofarmaceutickej oblasti.
Bezbunková technológia môže jednoducho a kontrolovaným spôsobom pridať množstvo prirodzene sa nevyskytujúcich aminokyselín, aby sa dosiahli zložité modifikačné procesy, ktoré sa ťažko riešia po konvenčnej rekombinantnej expresii. Takéto spôsoby majú vysokú aplikačnú hodnotu a potenciál na dodávanie liečiv a vývoj vakcín s použitím častíc podobných vírusom. Veľký počet membránových proteínov bol úspešne exprimovaný vo voľných bunkách.
Vyjadrenie skladieb
Rekombinantný proteín CFP10-ESAT 6 sa vyrába a používa na výrobu vakcín. Takýto alergén tuberkulózy vám umožňuje posilniť imunitný systém a vyvinúť protilátky. Vo všeobecnosti molekulárne štúdie zahŕňajú štúdium akéhokoľvek aspektu proteínu, ako je štruktúra, funkcia, modifikácie, lokalizácia alebo interakcie. Preskúmaťako špecifické látky regulujú vnútorné procesy, výskumníci zvyčajne vyžadujú prostriedky na výrobu funkčných zlúčenín, ktoré sú zaujímavé a prospešné.
Vzhľadom na veľkosť a zložitosť proteínov nie je chemická syntéza v tomto úsilí realizovateľná. Namiesto toho sa živé bunky a ich bunkové mechanizmy zvyčajne používajú ako továrne na vytváranie a konštrukciu látok na základe poskytnutých genetických šablón. Rekombinantný proteínový expresný systém potom generuje potrebnú štruktúru na vytvorenie liečiva. Ďalej nasleduje výber potrebného materiálu pre rôzne kategórie drog.
Na rozdiel od proteínov sa DNA dá ľahko skonštruovať synteticky alebo in vitro pomocou dobre zavedených rekombinantných techník. Preto môžu byť DNA templáty špecifických génov s alebo bez pridaných reportérových sekvencií alebo sekvencií afinitných tagov navrhnuté ako templáty na expresiu sledovanej látky. Takéto zlúčeniny odvodené z takýchto templátov DNA sa nazývajú rekombinantné proteíny.
Tradičné stratégie na expresiu látky zahŕňajú transfekciu buniek vektorom DNA, ktorý obsahuje templát, a potom kultiváciu buniek na transkripciu a transláciu požadovaného proteínu. Typicky sa bunky potom lýzujú, aby sa extrahovala exprimovaná zlúčenina na následné čistenie. Rekombinantný proteín CFP10-ESAT6 je spracovaný týmto spôsobom a prechádza purifikačným systémom z možnýchtvorba toxínov. Až potom ide syntetizovať do vakcíny.
Prokaryotické aj eukaryotické in vivo expresné systémy pre molekulárne látky sú široko používané. Výber systému závisí od typu proteínu, požiadavky na funkčnú aktivitu a požadovaného výťažku. Tieto expresné systémy zahŕňajú cicavce, hmyz, kvasinky, baktérie, riasy a bunky. Každý systém má svoje výhody a výzvy a výber správneho systému pre konkrétnu aplikáciu je dôležitý pre úspešné vyjadrenie skúmanej látky.
Výraz od cicavcov
Použitie rekombinantných proteínov umožňuje vývoj vakcín a liekov rôznych úrovní. Na tento účel možno použiť tento spôsob získania látky. Cicavčie expresné systémy sa môžu použiť na produkciu proteínov zo živočíšnej ríše, ktoré majú najprirodzenejšiu štruktúru a aktivitu v dôsledku ich fyziologicky relevantného prostredia. Výsledkom je vysoká úroveň post-translačného spracovania a funkčnej aktivity. Cicavčie expresné systémy sa môžu použiť na produkciu protilátok, komplexných proteínov a zlúčenín na použitie vo funkčných testoch na báze buniek. Tieto výhody sú však spojené s prísnejšími kultivačnými podmienkami.
Cicavčie expresné systémy môžu byť použité na generovanie proteínov prechodne alebo prostredníctvom stabilných bunkových línií, kde je expresný konštrukt integrovaný do hostiteľského genómu. Zatiaľ čo takéto systémy môžu byť použité vo viacerých experimentoch, časvýroba môže generovať veľké množstvo látky za jeden až dva týždne. Tento typ biotechnológie rekombinantných proteínov je veľmi žiadaný.
Tieto prechodné, vysoko výnosné cicavčie expresné systémy využívajú suspenzné kultúry a môžu poskytnúť gramy na liter. Okrem toho majú tieto proteíny v porovnaní s inými expresnými systémami viac prirodzeného skladania a posttranslačných modifikácií, ako je glykozylácia.
Výraz hmyzu
Metódy na produkciu rekombinantného proteínu nie sú obmedzené na cicavce. Existujú aj produktívnejšie spôsoby z hľadiska výrobných nákladov, hoci výťažnosť látky na 1 liter upravovanej kvapaliny je oveľa nižšia.
Hmyzí bunky môžu byť použité na expresiu vysokej hladiny proteínu s modifikáciami podobnými cicavčím systémom. Existuje niekoľko systémov, ktoré možno použiť na vytvorenie rekombinantného bakulovírusu, ktorý sa potom môže použiť na extrakciu záujmovej látky v bunkách hmyzu.
Expresie rekombinantných proteínov sa dajú ľahko zväčšiť a prispôsobiť na suspenznú kultúru s vysokou hustotou na zlučovanie molekúl vo veľkom meradle. Funkčne sa viac podobajú prirodzenému zloženiu hmoty cicavcov. Hoci výťažok môže byť až 500 mg/l, produkcia rekombinantného bakulovírusu môže byť časovo náročná a kultivačné podmienky sú ťažšie ako prokaryotické systémy. Avšak v južnejších a teplejších krajinách je to podobnémetóda sa považuje za efektívnejšiu.
Bakteriálny výraz
Produkciu rekombinantných proteínov možno dosiahnuť pomocou baktérií. Táto technológia sa výrazne líši od tých, ktoré sú opísané vyššie. Bakteriálne proteínové expresné systémy sú obľúbené, pretože baktérie sa ľahko kultivujú, rýchlo rastú a poskytujú vysoké výťažky rekombinantnej formulácie. Viacdoménové eukaryotické látky exprimované v baktériách sú však často nefunkčné, pretože bunky nie sú vybavené na vykonávanie nevyhnutných posttranslačných modifikácií alebo skladania molekúl.
Okrem toho sa mnohé proteíny stávajú nerozpustnými vo forme inklúznych molekúl, ktoré je veľmi ťažké získať späť bez drsných denaturátorov a následných ťažkopádnych postupov opätovného skladania molekúl. Táto metóda sa väčšinou stále považuje za experimentálnu.
Vyjadrenie bez buniek
Rekombinantný proteín obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu stafylokinázy sa získava trochu iným spôsobom. Je súčasťou mnohých typov injekcií, ktoré si pred použitím vyžadujú niekoľko systémov.
Proteínová expresia bez buniek je in vitro syntéza látky s použitím translačne kompatibilných extraktov celých buniek. V zásade extrakty celých buniek obsahujú všetky makromolekuly a zložky potrebné na transkripciu, transláciu a dokonca aj na posttranslačnú modifikáciu.
Tieto zložky zahŕňajú RNA polymerázu, regulačné proteínové faktory, transkripčné formy, ribozómy a tRNA. Pri pridávaníkofaktory, nukleotidy a špecifický génový templát dokážu tieto extrakty syntetizovať požadované proteíny za niekoľko hodín.
Aj keď to nie je udržateľné pre výrobu vo veľkom meradle, bezbunkové systémy alebo systémy expresie proteínov in vitro (IVT) ponúkajú množstvo výhod v porovnaní s konvenčnými systémami in vivo.
Bezbunková expresia umožňuje rýchlu syntézu rekombinantných formulácií bez zapojenia bunkovej kultúry. Bezbunkové systémy umožňujú značiť proteíny modifikovanými aminokyselinami, ako aj exprimovať zlúčeniny, ktoré podliehajú rýchlej proteolytickej degradácii intracelulárnymi proteázami. Okrem toho je jednoduchšie exprimovať veľa rôznych proteínov súčasne pomocou bezbunkovej metódy (napríklad testovanie mutácií proteínov expresiou v malom meradle z mnohých rôznych templátov rekombinantnej DNA). V tomto reprezentatívnom experimente sa na expresiu ľudského proteínu kaspázy-3 použil IVT systém.
Závery a vyhliadky do budúcnosti
Produkciu rekombinantných bielkovín možno teraz považovať za vyspelú disciplínu. Je to výsledok mnohých postupných zlepšení v čistení a analýze. V súčasnosti sa programy na objavovanie liekov len zriedka zastavujú kvôli neschopnosti produkovať cieľový proteín. Paralelné procesy na expresiu, čistenie a analýzu niekoľkých rekombinantných látok sú teraz dobre známe v mnohých laboratóriách po celom svete.
Proteínové komplexy a rastúci úspech vo výrobesolubilizované membránové štruktúry budú vyžadovať viac zmien, aby držali krok s dopytom. Vznik efektívnych zmluvných výskumných organizácií pre pravidelnejšie dodávky bielkovín umožní prerozdelenie vedeckých zdrojov na splnenie týchto nových výziev.
Paralelné pracovné postupy by navyše mali umožniť vytvorenie kompletných knižníc monitorovanej látky, aby sa umožnila nová cieľová identifikácia a pokročilý skríning spolu s tradičnými projektmi na objavovanie liekov s malými molekulami.
