Moderná biológia udivuje jedinečnosťou a rozsahom svojich objavov. Dnes táto veda študuje väčšinu procesov, ktoré sú našim očiam skryté. To je pozoruhodné pre molekulárnu biológiu – jednu zo sľubných oblastí, ktorá pomáha odhaliť najzložitejšie tajomstvá živej hmoty.
Čo je spätná transkripcia
Reverzná transkripcia (skrátene RT) je špecifický proces charakteristický pre väčšinu RNA vírusov. Jeho hlavnou črtou je syntéza dvojvláknovej molekuly DNA na báze messenger RNA.
OT nie je charakteristické pre baktérie alebo eukaryotické organizmy. Hlavný enzým, reverzná táza, hrá kľúčovú úlohu pri syntéze dvojvláknovej DNA.
História objavov
Myšlienka, že by sa molekula ribonukleovej kyseliny mohla stať šablónou pre syntézu DNA, bola až do 70. rokov minulého storočia považovaná za absurdnú. Potom B altimore a Temin, pracujúci oddelene od seba, takmer súčasne objavili nový enzým. Nazvali to RNA-dependentná-DNA polymeráza alebo reverzná transkriptáza.
Objav tohto enzýmu bezpodmienečne potvrdil existenciu organizmovschopné reverznej transkripcie. Obaja vedci dostali v roku 1975 Nobelovu cenu. Po nejakom čase Engelhardt navrhol alternatívny názov pre reverznú transkriptázu - revertáza.
Prečo OT odporuje centrálnej dogme molekulárnej biológie
Centrálna dogma je koncept sekvenčnej syntézy bielkovín v akejkoľvek živej bunke. Takáto schéma sa skladá z troch zložiek: DNA, RNA a proteínu.
Podľa centrálnej dogmy môže byť RNA syntetizovaná výlučne na templáte DNA a až potom sa RNA podieľa na budovaní primárnej štruktúry proteínu.
Táto dogma bola oficiálne prijatá vo vedeckej komunite ešte pred objavom reverznej transkripcie. Nie je prekvapením, že myšlienka reverznej syntézy DNA z RNA bola vedcami dlho odmietnutá. Až v roku 1970, spolu s objavom reverznej tázy, bol tento problém ukončený, čo sa odrazilo v koncepte syntézy bielkovín.
Revertáza vtáčích retrovírusov
Proces reverznej transkripcie nie je úplný bez účasti RNA-dependentnej DNA polymerázy. Revertáza vtáčieho retrovírusu bola doteraz študovaná v maximálnej miere.
V jednom virióne tejto rodiny vírusov možno nájsť len asi 40 molekúl tohto proteínu. Proteín pozostáva z dvoch podjednotiek, ktoré sú v rovnakom počte a vykonávajú tri dôležité funkcie reverzácie:
1) Syntéza molekuly DNA na templáte jednovláknovej/dvojvláknovej RNA a na báze deoxyribonukleových kyselín.
2) aktivácia RNázy H, ktorej hlavnou úlohou ještiepenie molekuly RNA v komplexe RNA-DNA.
3) Zničenie úsekov molekúl DNA na vloženie do eukaryotického genómu.
Mechanizmus OT
Kroky reverznej transkripcie sa môžu líšiť v závislosti od skupiny vírusov, t.j. na type ich nukleových kyselín.
Pozrime sa najprv na tie vírusy, ktoré využívajú reversetase. Tu je OT proces rozdelený do 3 krokov:
1) Syntéza „-“vlákna RNA na šablóne „+“vlákna RNA.
2) Deštrukcia "+" vlákna RNA v komplexe RNA-DNA pomocou enzýmu RNáza H.
3) Syntéza dvojvláknovej molekuly DNA na templáte "-" reťazca RNA.
Tento spôsob reprodukcie viriónov je typický pre niektoré onkogénne vírusy a vírus ľudskej imunodeficiencie (HIV).
Stojí za zmienku, že na syntézu akejkoľvek nukleovej kyseliny na templáte RNA je potrebné semeno alebo primér. Primér je krátka sekvencia nukleotidov, ktorá je komplementárna k 3' koncu molekuly RNA (šablóna) a hrá dôležitú úlohu pri iniciácii syntézy.
Keď sú hotové molekuly dvojvláknovej DNA vírusového pôvodu integrované do eukaryotického genómu, spustí sa obvyklý mechanizmus syntézy viriónových proteínov. Výsledkom je, že z bunky „zachytenej“vírusom sa stane továreň na výrobu viriónov, kde sa vo veľkých množstvách tvoria potrebné molekuly proteínu a RNA.
Ďalší spôsob reverznej transkripcie je založený na pôsobení RNA syntetázy. Tento proteín je aktívny v paramyxovírusoch, rabdovírusoch, pikornovírusoch. V tomto prípade neexistuje tretia etapa SZ – formáciadvojvláknová DNA a namiesto toho sa na templáte vírusového reťazca RNA „-“syntetizuje „+“reťazec RNA a naopak.
Opakovanie takýchto cyklov vedie tak k replikácii vírusového genómu, ako aj k vytvoreniu mRNA schopnej syntézy proteínov v podmienkach infikovanej eukaryotickej bunky.
Biologický význam reverznej transkripcie
Proces OT je mimoriadne dôležitý v životnom cykle mnohých vírusov (predovšetkým retrovírusov, ako je HIV). RNA viriónu, ktorý napadol eukaryotickú bunku, sa stáva templátom pre syntézu prvého vlákna DNA, na ktorom nie je ťažké dokončiť druhý reťazec.
Získaná dvojvláknová DNA vírusu je integrovaná do eukaryotického genómu, čo vedie k aktivácii procesov syntézy proteínov viriónu a objaveniu sa veľkého počtu jeho kópií vo vnútri infikovanej bunky. Toto je hlavná misia Revertase a OT vo všeobecnosti pre vírus.
Reverzná transkripcia sa môže vyskytnúť aj u eukaryotov v kontexte retrotranspozónov – mobilných genetických elementov, ktoré sa môžu nezávisle transportovať z jednej časti genómu do druhej. Takéto prvky podľa vedcov spôsobili evolúciu živých organizmov.
Retrotranspozón je úsek eukaryotickej DNA, ktorý kóduje niekoľko proteínov. Jedna z nich, reversetáza, sa priamo podieľa na delokalizácii takéhoto retrotransporozónu.
Použitie OT vo vede
Od chvíle, keď bola reverznátaáza izolovaná vo svojej čistej forme, biológovia prijali proces reverznej transkripcie. Štúdium mechanizmu OT stále pomáha čítať sekvencie najdôležitejších ľudských proteínov.
Faktom je, že genóm eukaryotov, vrátane nás, obsahuje neinformatívne oblasti nazývané intróny. Keď sa z takejto DNA načíta nukleotidová sekvencia a vytvorí sa jednovláknová RNA, táto stráca intróny a kóduje výlučne proteín. Ak sa DNA syntetizuje pomocou reverznej templáty RNA, potom je ľahké ju sekvenovať a zistiť poradie nukleotidov.
Nukleová kyselina, ktorá bola vytvorená reverznou transkriptázou, sa nazýva cDNA. Často sa používa v polymerázovej reťazovej reakcii (PCR) na umelé zvýšenie počtu kópií výslednej cDNA kópie. Táto metóda sa používa nielen vo vede, ale aj v medicíne: laboratórni asistenti určujú podobnosť takejto DNA s genómami rôznych baktérií alebo vírusov zo spoločnej knižnice. Syntéza vektorov a ich zavedenie do baktérií je jednou z perspektívnych oblastí biológie. Ak sa RT použije na vytvorenie DNA ľudí a iných organizmov bez intrónov, takéto molekuly sa môžu ľahko zaviesť do bakteriálneho genómu. Tie sa teda stávajú továrňami na výrobu látok potrebných pre človeka (napríklad enzýmov).
