Gramove farbenie je široko používané v mikrobiológii, pretože je to jeden z najjednoduchších spôsobov, ako rozlíšiť baktérie na základe zloženia ich bunkovej steny. Podľa Grama možno všetky baktérie rozdeliť na grampozitívne (Gram (+)) a gramnegatívne (Gram (-)). Metóda Gramovho farbenia bola vyvinutá v roku 1884 a odvtedy nestratila na popularite, hoci bola niekoľkokrát modifikovaná.
Štruktúra bunkovej steny
Gramove farbenie odhaľuje, či je baktéria Gram-pozitívna alebo Gram-negatívna. Rozdelenie baktérií na Gram (+) a Gram (-) sa uskutočňuje v súlade so štruktúrou ich bunkovej steny.
Bunková stena obsahuje najväčšie množstvo peptidoglykánu (mureínu) - komplexnej látky, ktorá zahŕňa peptapeptid a glykán. Glykán pozostáva zo striedajúcich sa zvyškov N-acetylglukózamínu a kyseliny N-acetylmurámovej, ktoré sú navzájom spojené β-1,4-glykozidové väzby. Peptidoglykán zabezpečuje udržanie tvaru buniek, osmotickú ochranu a antigénne funkcie.
Hlavné rozdiely medzi grampozitívnymi a gramnegatívnymi baktériami
Rôzne baktérie majú rôznu hrúbku peptidoglykánovej vrstvy. V baktériách, ktoré sú klasifikované ako grampozitívne, sa pohybuje od 15 do 80 nm, zatiaľ čo u gramnegatívnych je to od 2 do 8 nm. Gramnegatívne baktérie majú zároveň pod vrstvou peptidoglykánu špeciálnu štruktúru, ktorú grampozitívne baktérie nemajú – periplazmatický priestor. Tento priestor vypĺňajú hydrolytické enzýmy – β-laktamáza, ribonukleáza 1, fosfatáza. Práve tieto enzýmy sú zodpovedné za rezistenciu gramnegatívnych baktérií na mnohé antibiotiká.
Gram(-)peptidoglykánová vrstva baktérií je naviazaná na lipopolysacharid, antigénnu štruktúru obsahujúcu endotoxín. V Gram(+) baktériách vykonávajú teichoové kyseliny podobné funkcie.
Gramnegatívne baktérie majú dodatočnú štruktúru – vonkajšiu membránu.
Podstata metódy farbenia
Pred začatím farbenia sa pripravia nátery študovaných baktérií. Na to sa na podložné sklíčko nakvapká voda a pridá sa tam kultúra mikroorganizmov s bakteriálnou slučkou. Potom, po úplnom vyschnutí vody, sa náter zafixuje - sklíčko sa niekoľkokrát prenesie nad plameňom horáka. Gramovo farbenie je účinnejšie ako farbenie živými baktériami – molekuly farbiva sa lepšie viažu na mŕtve bunky.
Sfarbenie prebieha v niekoľkých fázach:
- Malé kúsky filtračného papiera sa umiestnia na pevnú škvrnu a naleje sa hlavné farbivo - genciánová violeť alebo metylénová modrá.
- Po 3-5 minútach odstráňte farebný filtračný papier a naplňte náter Lugolovým roztokom na 1 minútu. V tomto prípade prípravok stmavne.
- Lugolov roztok sa scedí a náter sa ošetrí čistým etylalkoholom: na prípravok sa nakvapká niekoľko kvapiek a po 20 sekundách sa scedí. Postup sa opakuje 2-3 krát.
- Opláchnite testovacie sklíčko destilovanou vodou.
- Vyrobte dodatočné farbenie - dokončite prípravok fuchsínom. Po 1-2 minútach sa farbivo zmyje.
- Po zaschnutí vody preskúmajte náter pod mikroskopom. Gram-pozitívne baktérie budú modrofialové, gramnegatívne baktérie budú ružové alebo červené.
Príčiny rôznych vzorov sfarbenia
Ako je popísané vyššie, Gram-farbenie baktérií farbí gram-pozitívne baktérie modro-fialové, zatiaľ čo Gram-negatívne baktérie farbia červeno alebo ružovo. Dôvodom rozdielneho farbenia baktérií touto metódou je, že po vstupe rozpustnej formy genciánovej violeti do bunky prechádza farbivo do nerozpustnej formy jódu. Počas ošetrenia baktérií etylalkoholom sa lipidy extrahujú z membrány pôsobením tohto nepolárneho rozpúšťadla. Membrána sa potom stáva poréznou a už nie je významnou prekážkou pre vylúhovanie farbiva. Avšakpeptidoglykán je odolnejší voči nepolárnym rozpúšťadlám vrátane alkoholu. Práve on bráni vymývaniu farbiva, takže baktérie s hrubou mureínovou vrstvou sa sfarbia do modrofialova (grampozitívne) a po ošetrení alkoholom nemenia svoju farbu.
Tenká mureínová vrstva gramnegatívnych baktérií nedokáže udržať molekuly farbiva v bunke, takže po pôsobení alkoholu sa stanú bezfarebnými - farbia sa gramnegatívne.
Po vystavení náteru fuchsínom zostávajú gramne zafarbené baktérie modrofialové, zatiaľ čo gramnegatívne baktérie sa stávajú ružovočervenými.
Príklady Gram(+) a Gram(-) baktérií
Gram-negatívne baktérie zahŕňajú cyanobaktérie, sírne baktérie, železité baktérie, chlamýdie, rickettsie, octové baktérie, mnohé metylobaktérie, tionové baktérie, arsenitobaktérie, karboxybaktérie.
Bifidobaktérie, mnohé vodné baktérie, streptokoky a stafylokoky sú grampozitívne.
