Existuje mnoho rôznych metód na analýzu zloženia a štúdium vlastností rôznych zlúčenín a zmesí látok. Jednou z takýchto metód je chromatografia. Autorstvo na vynáleze a aplikácii metódy patrí ruskému botanikovi M. S. Tsvetovi, ktorý na začiatku 20. storočia realizoval separáciu rastlinných pigmentov.
Definícia a základy metódy
Chromatografia je fyzikálno-chemická metóda na separáciu zmesí a stanovenie ich zložiek, založená na distribúcii medzi mobilnou a stacionárnou fázou látok, ktoré tvoria zmes (vzorku). Stacionárna fáza je porézna tuhá látka - sorbent. Môže to byť aj tekutý film nanesený na pevný povrch. Mobilná fáza – eluent – sa musí pohybovať pozdĺž stacionárnej fázy alebo ňou pretekať, pričom je filtrovaná sorbentom.
Podstatou chromatografie je, že rôzne zložky zmesi sa nevyhnutne vyznačujú rôznymi vlastnosťami, ako je molekulová hmotnosť, rozpustnosť, adsorbovateľnosť atď. Preto miera interakcie zložiek mobilnej fázy - sorbátov - so stacionárnyminie je to to isté. To vedie k rozdielu v rýchlostiach molekúl zmesi voči stacionárnej fáze, v dôsledku čoho sa zložky oddeľujú a koncentrujú v rôznych zónach sorbentu. Niektoré z nich opúšťajú sorbent spolu s mobilnou fázou - ide o takzvané nezadržané zložky.
Špeciálnou výhodou chromatografie je, že umožňuje rýchlo oddeliť zložité zmesi látok, vrátane tých s podobnými vlastnosťami.
Metódy na klasifikáciu typov chromatografie
Metódy použité pri analýze možno klasifikovať podľa rôznych kritérií. Hlavný súbor takýchto kritérií je nasledujúci:
- súhrnný stav stacionárnych a mobilných fáz;
- fyzikálna a chemická povaha interakcie sorbentu a sorbátov;
- ako zaviesť eluent a presunúť ho;
- spôsob umiestnenia stacionárnej fázy, t.j. chromatografická technika;
- ciele chromatografie.
Okrem toho môžu byť metódy založené na odlišnej povahe sorpčného procesu, na technických podmienkach chromatografickej separácie (napríklad nízky alebo vysoký tlak).
Pozrime sa bližšie na vyššie uvedené hlavné kritériá a s nimi spojené najpoužívanejšie typy chromatografie.
Stav agregácie eluentu a sorbentu
Na tomto základe sa chromatografia delí na kvapalinovú a plynovú. Názvy metód odrážajú stav mobilnej fázy.
Kvapalinová chromatografia je používaná technikav procesoch separácie zmesí makromolekulárnych zlúčenín vrátane biologicky významných. V závislosti od stavu agregácie sorbentu sa delí na fázu kvapalina-kvapalina a kvapalina-tuhá fáza.
Plynová chromatografia je nasledujúcich typov:
- Adsorpcia plynu (plyn-tuhá fáza), ktorá využíva pevný sorbent, ako je uhlie, silikagél, zeolity alebo porézne polyméry. Inertný plyn (argón, hélium), dusík, oxid uhličitý pôsobí ako eluent – nosič separovanej zmesi. Separácia prchavých zložiek zmesi sa uskutočňuje v dôsledku rôzneho stupňa ich adsorpcie.
- Plyn-kvapalina. Stacionárna fáza v tomto prípade pozostáva z tekutého filmu naneseného na pevnom inertnom základe. Zložky vzorky sú oddelené podľa ich adsorbovateľnosti alebo rozpustnosti.
Plynová chromatografia je široko používaná na analýzu zmesí organických zlúčenín (s využitím produktov ich rozkladu alebo derivátov v plynnej forme).
Interakcia medzi sorbentom a sorbátmi
Podľa tohto kritéria sa rozlišujú tieto typy:
- Adsorpčná chromatografia, pomocou ktorej sa separujú zmesi z dôvodu rozdielov v stupni adsorpcie látok imobilným sorbentom.
- Distribúcia. S jeho pomocou sa separácia uskutočňuje na základe rôznej rozpustnosti zložiek zmesi. Rozpúšťanie prebieha buď v mobilnej a stacionárnej fáze (v kvapalinovej chromatografii), alebo iba v stacionárnej fáze (v plyne a kvapalinechromatografia).
- Sedimentárne. Táto chromatografická metóda je založená na rozdielnej rozpustnosti vytvorených precipitátov látok, ktoré sa majú oddeliť.
- Vylúčenie alebo gélová chromatografia. Vychádza z rozdielu vo veľkosti molekúl, vďaka čomu sa mení ich schopnosť prenikať do pórov sorbentu, takzvanej gélovej matrice.
- Affine. Táto špecifická metóda, ktorá je založená na špeciálnom type biochemickej interakcie separovaných nečistôt s ligandom, ktorý tvorí komplexnú zlúčeninu s inertným nosičom v stacionárnej fáze. Táto metóda je účinná pri oddeľovaní zmesí proteín-enzýmy a je bežná v biochémii.
- Výmena iónov. Ako separačný faktor vzorky využíva táto metóda rozdiel v schopnosti zložiek zmesi k iónovej výmene so stacionárnou fázou (iónomeničom). V priebehu procesu sú ióny stacionárnej fázy nahradené iónmi látok v zložení eluentu, pričom v dôsledku ich rozdielnej afinity k iónomeniču vzniká rozdiel v rýchlosti ich pohybu, a teda v zmes sa oddelí. Pre stacionárnu fázu sa najčastejšie používajú iónomeničové živice - špeciálne syntetické polyméry.
Ionovo-výmenná chromatografia má dve možnosti – aniónovú (zadržiava záporné ióny) a katiónovú (zachováva kladné ióny). Táto metóda sa používa mimoriadne široko: pri separácii elektrolytov, prvkov vzácnych zemín a transuránu, pri čistení vody, pri analýze liečiv.
Rozdiel v metódach techniky
Existujú dva hlavné spôsoby, ktorými sa vzorka pohybuje vzhľadom na stacionárnu fázu:
- Stĺpcová chromatografia vykonáva separačný proces v špeciálnom zariadení - chromatografická kolóna - trubica, v ktorej vnútornej dutine je umiestnený nepohyblivý sorbent. Podľa spôsobu plnenia sa kolóny delia na dva typy: plnené (tzv. "balené") a kapilárne, pri ktorých je na povrch nanesená vrstva pevného sorbentu alebo tekutý film stacionárnej fázy. vnútorná stena. Balené stĺpy môžu mať rôzne tvary: rovné, v tvare U, špirálové. Kapilárne stĺpce sú špirálovité.
- Planárna (planárna) chromatografia. V tomto prípade je možné ako nosič stacionárnej fázy použiť špeciálny papier alebo doštičku (kov, sklo alebo plast), na ktorú je nanesená tenká vrstva sorbentu. V tomto prípade sa chromatografická metóda označuje ako papierová alebo tenkovrstvová chromatografia.
Na rozdiel od kolónovej metódy, kde sa chromatografické kolóny používajú opakovane, pri planárnej chromatografii je možné akýkoľvek nosič s vrstvou sorbentu použiť iba raz. Proces separácie nastáva, keď je tanier alebo list papiera ponorený do nádoby s eluentom.
Zavedenie a prenos eluentu
Tento faktor určuje charakter pohybu chromatografických zón pozdĺž vrstvy sorbentu, ktoré vznikajú pri separácii zmesi. Existujú nasledujúce spôsoby dodávania eluentov:
- Predná časť. Táto metóda je najjednoduchšiatechnika vykonávania. Mobilnou fázou je priamo samotná vzorka, ktorá je kontinuálne privádzaná do kolóny naplnenej sorbentom. V tomto prípade sa najmenej zadržaná zložka, adsorbovaná horšie ako ostatné, pohybuje pozdĺž sorbentu rýchlejšie ako ostatné. Výsledkom je, že iba táto prvá zložka môže byť izolovaná v čistej forme, po ktorej nasledujú zóny obsahujúce zmesi zložiek. Distribúcia vzorky vyzerá takto: A; A+B; A+B+C a tak ďalej. Frontálna chromatografia preto nie je užitočná na separáciu zmesí, ale je účinná pri rôznych procesoch čistenia za predpokladu, že látka, ktorá sa má izolovať, má nízku retenciu.
- Vytesňovacia metóda sa líši v tom, že po vstupe do separovanej zmesi sa do kolóny privádza eluent so špeciálnym vytesňovačom - látka vyznačujúca sa väčšou sorbovateľnosťou ako ktorákoľvek zo zložiek zmesi. Premiestňuje najzadržanejšiu zložku, ktorá premiestňuje ďalšiu atď. Vzorka sa pohybuje pozdĺž kolóny rýchlosťou vytesňovača a vytvára priľahlé zóny koncentrácie. Pri tomto type chromatografie je možné každú zložku získať jednotlivo v kvapalnej forme na výstupe z kolóny.
- Metóda eluentu (vyvolávacia) je najbežnejšia. Na rozdiel od vytesňovacej metódy má eluent (nosič) v tomto prípade nižšiu sorbovateľnosť ako zložky vzorky. Nepretržite prechádza cez vrstvu sorbentu a premýva ju. Periodicky, po častiach (impulzoch) sa zmes, ktorá sa má separovať, zavádza do prúdu eluentu, potom sa opäť privádza čistý eluent. Pri vymývaní (elúcii) sa zložky oddelia,navyše ich koncentračné zóny sú oddelené zónami eluentu.
Eluentová chromatografia umožňuje takmer úplne oddeliť analyzovanú zmes látok a zmes môže byť viaczložková. Výhodou tejto metódy je tiež vzájomná izolácia zložiek a jednoduchosť kvantitatívnej analýzy zmesi. Medzi nevýhody patrí vysoká spotreba eluentu a nízka koncentrácia zložiek vzorky v ňom po separácii na výstupe z kolóny. Metóda eluentu je široko používaná v plynovej aj kvapalinovej chromatografii.
Chromatografické procesy v závislosti od účelu
Rozdiel v cieľoch chromatografie umožňuje rozlíšiť metódy ako analytické, preparatívne a priemyselné.
Prostredníctvom analytickej chromatografie sa vykonáva kvalitatívna a kvantitatívna analýza zmesí. Pri analýze zložiek vzorky, keď opúšťajú kolónu chromatografu, idú do detektora - zariadenia, ktoré je citlivé na zmeny koncentrácie látky v eluente. Čas, ktorý uplynie od okamihu vloženia vzorky do kolóny do maximálnej maximálnej koncentrácie látky na detektore, sa nazýva retenčný čas. Za predpokladu, že teplota kolóny a rýchlosť eluentu sú konštantné, je táto hodnota konštantná pre každú látku a slúži ako základ pre kvalitatívnu analýzu zmesi. Kvantitatívna analýza sa vykonáva meraním plochy jednotlivých píkov v chromatograme. V analytickej chromatografii sa spravidla používa eluentová metóda.
Preparatívna chromatografia má za cieľ izolovať čisté látky zo zmesi. Prípravné kolóny majú oveľa väčšiepriemer ako analytický.
Priemyselná chromatografia sa používa v prvom rade na získanie veľkého množstva čistých látok potrebných v konkrétnej výrobe. Po druhé, je dôležitou súčasťou moderných riadiacich a regulačných systémov technologických procesov.
Priemyselný chromatograf má stupnicu koncentrácie jednej alebo druhej zložky a je vybavený senzorom, ako aj riadiacimi a registračnými systémami. Vzorky sa do takýchto chromatografov dodávajú automaticky s určitou frekvenciou.
Multifunkčné chromatografické vybavenie
Moderné chromatografy sú zložité high-tech zariadenia, ktoré sa dajú použiť v rôznych oblastiach a na rôzne účely. Tieto zariadenia umožňujú analyzovať zložité viaczložkové zmesi. Sú vybavené širokou škálou detektorov: tepelne konduktometrické, optické, ionizačné, hmotnostne spektrometrické a tak ďalej.
Moderná chromatografia navyše využíva automatické riadiace systémy na analýzu a spracovanie chromatogramov. Ovládanie je možné vykonať z počítača alebo priamo zo zariadenia.
Príkladom takéhoto zariadenia je multifunkčný plynový chromatograf „Crystal 5000“. Má súpravu štyroch vymeniteľných detektorov, stĺpcový termostat, elektronické systémy riadenia tlaku a prietoku a ovládanie plynových ventilov. Na vyriešenie rôznych problémov má zariadenieschopnosť inštalovať plnené aj kapilárne kolóny.
Chromatograf sa ovláda pomocou plnohodnotnej klávesnice a ovládacieho displeja alebo (v inej modifikácii) z osobného počítača. Toto zariadenie novej generácie možno efektívne využiť vo výrobe a v rôznych výskumných laboratóriách: medicínske, forenzné, environmentálne.
Vysokotlaková chromatografia
Uskutočňovanie kvapalinovej stĺpcovej chromatografie sa vyznačuje pomerne dlhým trvaním procesu. Na urýchlenie pohybu kvapalného eluentu sa využíva prívod mobilnej fázy do kolóny pod tlakom. Táto moderná a veľmi sľubná metóda sa nazýva vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC).
Pumpový systém kvapalinového chromatografu HPLC dodáva eluent konštantnou rýchlosťou. Vyvinutý vstupný tlak môže dosiahnuť 40 MPa. Počítačové riadenie umožňuje meniť zloženie mobilnej fázy podľa daného programu (tento spôsob elúcie sa nazýva gradient).
HPLC možno použiť rôznymi metódami založenými na povahe interakcie sorbentu a sorbátu: distribúcia, adsorpcia, vylučovanie podľa veľkosti, iónovo-výmenná chromatografia. Najbežnejším typom HPLC je metóda s reverznou fázou, založená na hydrofóbnej interakcii polárnej (vodnej) mobilnej fázy a nepolárneho sorbentu, ako je silikagél.
Metóda je široko používaná na separáciu, analýzu,kontrola kvality neprchavých, tepelne nestabilných látok, ktoré sa nedajú premeniť na plynné skupenstvo. Ide o agrochemikálie, liečivá, zložky potravín a iné zložité látky.
Význam chromatografických štúdií
V rôznych oblastiach sa široko používajú rôzne typy chromatografie:
- anorganická chémia;
- petrochemikálie a baníctvo;
- biochémia;
- medicína a liečivá;
- potravinársky priemysel;
- ekológia;
- kriminológia.
Tento zoznam je neúplný, ale odráža pokrytie odvetví, ktoré sa nezaobídu bez chromatografických metód analýzy, separácie a čistenia látok. Vo všetkých oblastiach použitia chromatografie, od vedeckých laboratórií až po priemyselnú výrobu, sa úloha týchto metód ešte viac zvyšuje so zavádzaním moderných technológií na spracovanie informácií, riadenie a kontrolu zložitých procesov.
