Absorpcia a ďalšia reemisia svetla anorganickými a organickými médiami je výsledkom fosforescencie alebo fluorescencie. Rozdiel medzi javmi je dĺžka intervalu medzi absorpciou svetla a emisiou prúdu. Pri fluorescencii sa tieto procesy vyskytujú takmer súčasne a pri fosforescencii s určitým oneskorením.
Historické pozadie
V roku 1852 britský vedec Stokes prvýkrát opísal fluorescenciu. Nový termín vytvoril ako výsledok svojich experimentov s kazivcom, ktorý pri vystavení ultrafialovému svetlu vyžaroval červené svetlo. Stokes zaznamenal zaujímavý fenomén. Zistil, že vlnová dĺžka fluorescenčného svetla je vždy dlhšia ako vlnová dĺžka excitačného svetla.
V 19. storočí sa uskutočnilo veľa experimentov na potvrdenie hypotézy. Ukázali, že rôzne vzorky fluoreskujú, keď sú vystavené ultrafialovému svetlu. Materiály zahŕňali okrem iného kryštály, živice, minerály, chlorofyl,liečivé suroviny, anorganické zlúčeniny, vitamíny, oleje. Priame používanie farbív na biologickú analýzu sa začalo až v roku 1930
Popis fluorescenčnej mikroskopie
Niektoré materiály používané pri výskume v prvej polovici 20. storočia boli vysoko špecifické. Vďaka indikátorom, ktoré nebolo možné dosiahnuť kontrastnými metódami, sa metóda fluorescenčnej mikroskopie stala dôležitým nástrojom v biomedicínskom aj biologickom výskume. Získané výsledky nemali malý význam pre vedu o materiáloch.
Aké sú výhody fluorescenčnej mikroskopie? Pomocou nových materiálov bolo možné izolovať vysoko špecifické bunky a submikroskopické komponenty. Fluorescenčný mikroskop umožňuje detekovať jednotlivé molekuly. Rôzne farbivá vám umožňujú identifikovať niekoľko prvkov súčasne. Aj keď je priestorové rozlíšenie zariadenia obmedzené difrakčným limitom, ktorý zase závisí od špecifických vlastností vzorky, detekcia molekúl pod touto úrovňou je tiež celkom možná. Rôzne vzorky vykazujú po ožiarení autofluorescenciu. Tento jav je široko používaný v petrológii, botanike, polovodičovom priemysle.
Funkcie
Štúdium živočíšnych tkanív alebo patogénnych mikroorganizmov je často komplikované buď príliš slabou alebo veľmi silnou nešpecifickou autofluorescenciou. Avšak hodnota vvýskum získava zavedenie do materiálu súčiastok excitovaných špecifickou vlnovou dĺžkou a emitujúcich svetelný tok požadovanej intenzity. Fluorochrómy pôsobia ako farbivá schopné samoprichytenia sa na štruktúry (neviditeľné alebo viditeľné). Zároveň sa vyznačujú vysokou selektivitou vzhľadom na ciele a kvantový výnos.
Fluorescenčná mikroskopia sa stala široko používanou s príchodom prírodných a syntetických farbív. Mali špecifické profily intenzity emisií a excitácie a boli zamerané na špecifické biologické ciele.
Identifikácia jednotlivých molekúl
Často za ideálnych podmienok dokážete zaregistrovať žiaru jedného prvku. K tomu je okrem iného potrebné zabezpečiť dostatočne nízky šum detektora a optické pozadie. Molekula fluoresceínu môže emitovať až 300 000 fotónov pred zničením v dôsledku fotobielenia. S 20% mierou zberu a efektivitou procesu ich možno zaregistrovať v hodnote cca 60 tisíc
Fluorescenčná mikroskopia založená na lavínových fotodiódach alebo elektrónovom multiplikovaní umožnila výskumníkom pozorovať správanie jednotlivých molekúl niekoľko sekúnd a v niektorých prípadoch aj minút.
Ťažkosti
Kľúčovým problémom je potlačenie šumu z optického pozadia. Vzhľadom na to, že mnohé materiály používané pri konštrukcii filtrov a šošoviek vykazujú určitú autofluorescenciu, úsilie vedcov sa v počiatočných fázach sústredilo na vydávaniekomponenty s nízkou fluorescenciou. Nasledujúce experimenty však viedli k novým záverom. Konkrétne sa zistilo, že fluorescenčná mikroskopia založená na úplnom vnútornom odraze dosahuje nízke pozadie a vysoký výstup excitačného svetla.
Mechanizmus
Princípy fluorescenčnej mikroskopie založenej na úplnom vnútornom odraze spočívajú v použití rýchlo sa rozpadajúcej alebo nešíriacej sa vlny. Vzniká na rozhraní medzi médiami s rôznymi indexmi lomu. V tomto prípade svetelný lúč prechádza cez hranol. Má vysoký index lomu.
Prizma susedí s vodným roztokom alebo sklom s nízkymi parametrami. Ak je lúč svetla nasmerovaný pod uhlom, ktorý je väčší ako kritický, lúč sa úplne odrazí od rozhrania. Tento jav zase vedie k nešíriacej sa vlne. Inými slovami, vytvára sa elektromagnetické pole, ktoré preniká médiom s nižším indexom lomu vo vzdialenosti menšej ako 200 nanometrov.
V nešíriacej sa vlne bude intenzita svetla úplne dostatočná na vybudenie fluorofórov. Vzhľadom na jeho výnimočne malú hĺbku však bude jeho objem veľmi malý. Výsledkom je pozadie nízkej úrovne.
Úprava
Fluorescenčná mikroskopia založená na úplnom vnútornom odraze môže byť realizovaná s epiilumináciou. To si vyžaduje šošovky so zvýšenou numerickou apertúrou (najmenej 1,4, ale je žiaduce, aby dosahovala 1,45-1,6), ako aj čiastočne osvetlené pole prístroja. To posledné sa dosiahne malým bodom. Pre väčšiu rovnomernosť sa používa tenký krúžok, cez ktorý je časť prietoku zablokovaná. Na získanie kritického uhla, po ktorom dôjde k úplnému odrazu, je potrebná vysoká úroveň lomu imerzného média v šošovkách a krycom skle mikroskopu.
